[論文レビュー] Reaction of the desulfoferrodoxin from Desulfoarculus baarsii with superoxide anion. Evidence for a superoxide reductase activity

Murielle Lombard, Marc Fontecave+2 more|PubMed|Dec 16, 2014

Environmental Toxicology and Ecotoxicology参考文献 26被引用数 133

ひとこと要約

本研究では、*Desulfoarculus baarsii* のデスルホフェロドキシンがスーパオキサイドジスムターゼではなくスーパオキサイドレダクターゼとして機能することを示している。この酵素はフェロウス鉄中心を介してスーパオキサイドアニオン（O₂⁻）を効率的に還元し、反応速度定数は6–7 × 10⁸ M⁻¹s⁻¹である。酵素は *E. coli* の抽出物においてNADH/NADPHによって再生され、硫酸還元細菌に新たな抗酸化機構が存在することを示している。

ABSTRACT

Desulfoferrodoxin is a small protein found in sulfate-reducing bacteria that contains two independent mononuclear iron centers, one ferric and one ferrous. Expression of desulfoferrodoxin from Desulfoarculus baarsii has been reported to functionally complement a superoxide dismutase deficient Escherichia coli strain. To elucidate by which mechanism desulfoferrodoxin could substitute for superoxide dismutase in E. coli, we have purified the recombinant protein and studied its reactivity toward O-(2). Desulfoferrodoxin exhibited only a weak superoxide dismutase activity (20 units mg(-1)) that could hardly account for its antioxidant properties. UV-visible and electron paramagnetic resonance spectroscopy studies revealed that the ferrous center of desulfoferrodoxin could specifically and efficiently reduce O-(2), with a rate constant of 6-7 x 10(8) M(-1) s(-1). In addition, we showed that membrane and cytoplasmic E. coli protein extracts, using NADH and NADPH as electron donors, could reduce the O-(2) oxidized form of desulfoferrodoxin. Taken together, these results strongly suggest that desulfoferrodoxin behaves as a superoxide reductase enzyme and thus provide new insights into the biological mechanisms designed for protection from oxidative stresses.

研究の動機と目的

• デスルホフェロドキシンが *E. coli* のスーパオキサイドジスムターゼ欠損を補完する生化学的メカニズムを解明すること。
• デスルホフェロドキシンがスーパオキサイドジスムターゼとして機能するか、あるいは代替の抗酸化酵素として機能するかを明確にすること。
• 二つの鉄中心がスーパオキサイドアニオン（O₂⁻）に対して示す赤酸化特性および反応性を調査すること。
• 生理的電子供与体（NADH/NADPH）がタンパク質の酸化状態を再生する役割を評価すること。
• フェロウス鉄中心によるスーパオキサイド還元の速度定数を決定すること。

提案手法

• 再結合型デスルホフェロドキシンを *E. coli* から高純度に精製し、動態および分光的分析に用いた。
• 紫外可視および電子スピン共鳴（EPR）分光法を用いて、スーパオキサイド反応中の鉄中心の変化をモニタリングした。
• ストップ・フロー法による動態測定を実施し、フェロウス中心によるスーパオキサイド還元の速度定数を決定した。
• *E. coli* の細胞質および膜タンパク質抽出物を用い、NADHおよびNADPHを電子供与体として、酸化状態デスルホフェロドキシンの還元能を評価した。
• キサンチン-キサンインオキシダーゼ系を用いた分光法によるスーパオキサイドジスムターゼ（SOD）活性の測定を実施した。
• 酸素ラジカルによる干渉を避けるため、嫌気的条件下でタンパク質の反応性を評価した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 デスルホフェロドキシンはスーパオキサイドジスムターゼ活性を示すか。その活性は既知のSODと比較してどの程度効率的か？
• RQ2 デスルホフェロドキシンのフェロウス鉄中心は直接的にスーパオキサイドアニオンを還元可能か。その反応速度定数はいかほどか？
• RQ3 *E. coli* における生理的電子供与体（NADHおよびNADPH）は、酸化状態のデスルホフェロドキシンを再生可能か？
• RQ4 デスルホフェロドキシンの二つの特徴的な鉄中心が、スーパオキサイドと相互作用する役割は何か？
• RQ5 デスルホフェロドキシンは生体内において主にスーパオキサイドレダクターゼとして機能するのか、それともスーパオキサイドジスムターゼとして機能するのか？

主な発見

• デスルホフェロドキシンは弱いスーパオキサイドジスムターゼ活性（20単位 mg⁻¹）を示すが、これはSOD欠損 *E. coli* における機能的補完を説明するには不十分である。
• フェロウス鉄中心はスーパオキサイドアニオンを第二級速度定数6–7 × 10⁸ M⁻¹s⁻¹で特異的に還元し、高い触媒効率を示している。
• 紫外可視およびEPR分光法により、フェロウス中心がスーパオキサイド還元の部位であり、酸化状態（フェリック状態）に移行することが確認された。
• *E. coli* の細胞質および膜抽出物は、NADHまたはNADPHを供給することで、酸化状態（フェリック状態）のデスルホフェロドキシンを効率的に再生した。
• 生理的電子供与体が存在する条件下で、フェロウス状態とフェリック状態の間を周期的に入れ替える能力が、スーパオキサイドレダクターメカニズムを支持する。
• これらのデータは、デスルホフェロドキシンが主にスーパオキサイドレダクターゼとして機能しており、硫酸還元細菌に新たな抗酸化経路が存在することを総合的に示している。