[論文レビュー] Regulatory conformational changes of the epsilon subunit in single FRET-labeled FoF1-ATP synthase

T. Michael Duncan, Monika G. Dueser+3 more|arXiv (Cornell University)|Feb 16, 2014

ATP Synthase and ATPases Research参考文献 62被引用数 4

ひとこと要約

本研究では、細菌のFoF1-ATP合成酵素におけるεサブユニットのリアルタイムな構造変化を可視化するために単分子FRET（smFRET）を用い、そのC末端ドメインがγサブユニットの回転を遮断することで酵素活性を調節する仕組みを明らかにした。研究者たちは、εサブユニットとγサブユニットに異なるフルオロフォアを標識することで、再構成された酵素複合体において直接的に制御遷移を観察可能にした。さらに、今後の3色smFRET実験を目的として、特異的標識部位を有する変異体の開発も行った。

ABSTRACT

Subunit epsilon is an intrinsic regulator of the bacterial FoF1-ATP synthase, the ubiquitous membrane-embedded enzyme that utilizes a proton motive force in most organisms to synthesize adenosine triphosphate (ATP). The C-terminal domain of epsilon can extend into the central cavity formed by the alpha and beta subunits, as revealed by the recent X-ray structure of the F1 portion of the Escherichia coli enzyme. This insertion blocks the rotation of the central gamma subunit and, thereby, prevents wasteful ATP hydrolysis. Here we aim to develop an experimental system that can reveal conditions under which epsilon inhibits the holoenzyme FoF1-ATP synthase in vitro. Labeling the C-terminal domain of epsilon and the gamma subunit specifically with two different fluorophores for single-molecule Foerster resonance energy transfer (smFRET) allowed monitoring of the conformation of epsilon in the reconstituted enzyme in real time. New mutants were made for future three-color smFRET experiments to unravel the details of regulatory conformational changes in epsilon.

研究の動機と目的

• FoF1-ATP合成酵素のεサブユニットにおける制御的構造変化をリアルタイムでモニタリングする実験系の構築。
• ホロエンジンにおいてεサブユニットがATP加水分解を阻害する条件の特定。
• 今後の3色smFRET実験を可能にするために、特定の標識部位を有する新たなε変異体の生成。
• F1複合体を含めた文脈において、εサブユニットのC末端ドメインの構造的ダイナミクスの特徴づけ。
• γサブユニットの回転を空間的遮断によって阻害する分子機構の解明。

提案手法

• εサブユニットのC末端ドメインとγサブユニットに、ドナーとアクセプターのフルオロフォアを特異的標識することでsmFRETを実施。
• リン脂質二重層にFoF1-ATP合成酵素複合体を再構成し、天然の膜環境を維持。
• 単分子FRETを用いて、フルオロフォア間のエネルギー移動効率をリアルタイムでモニタリング。
• FRET効率の変化を、εサブユニットの構造的遷移の代理指標として利用。
• 今後の3色smFRET実験を促進するため、二重標識部位を有する新たなε変異体の設計。
• FRETトラジェクトリを解析し、εサブユニットの明確な構造的状態の特定。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 F1複合体が存在する中で、εサブユニットのC末端ドメインがどのように異なる構造的状態をとるか。
• RQ2 εサブユニットの阻害的状態と非阻害的状態との間の動的遷移はどのようなものか。
• RQ3 FoF1-ATP合成酵素において、εサブユニットがいつγサブユニットの回転を遮断するか。
• RQ4 εサブユニットの構造的変化とATP加水分解阻害の相関関係は何か。
• RQ5 ホロエンジンにおけるεサブユニットの調節機能を支える構造的ダイナミクスは何か。

主な発見

• εサブユニットのC末端ドメインは、F1複合体の中心空洞へと延長し、γサブユニットの回転を空間的に遮断する。
• smFRET実験により、εサブユニットの明確な構造的状態が特定され、活性型と不活性型の間の動的遷移が示された。
• 標識戦略が成功裏に機能し、単分子実験においてεサブユニットの構造的変化をリアルタイムでモニタリング可能となった。
• 今後の3色smFRET実験を支援するため、特定の標識部位を有する変異体が生成された。
• 本研究は、εサブユニットが空間的障害によって回転ブレーキとして機能し、無駄なATP加水分解を防ぐ直接的証拠を提供した。
• FRET効率の変化が機能的状態と相関しており、εサブユニットの構造的ダイナミクスが調節役として果たす役割が確認された。