[論文レビュー] Scanning Fluorescence Correlation Spectroscopy (SFCS) with a Scan Path Perpendicular to the Membrane Plane

Paul Müller, Petra Schwille+1 more|arXiv (Cornell University)|May 31, 2018

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques参考文献 14被引用数 10

ひとこと要約

本論文は、巨大単層膜小胞（GUVs）において膜面に垂直なスキャンパスを用いたスキャン蛍光関連分光法（SFCS）を実行する、プラットフォーム非依存でオープンソースのソフトウェアパイプライン（PyScanFCSおよびPyCorrFit）を紹介する。kHz周波数のスキャンにおいて、測定後に行うスキャンのアラインメントと光子トレースの相関を可能にすることで、従来のFCSが膜研究において抱える運動に起因するアーチファクトや光不活性化の制限を克服し、膜二重層内での拡散係数および分子相互作用の正確な測定が可能になり、安定性と信号対雑音比が向上する。

ABSTRACT

Scanning fluorescence correlation spectroscopy (SFCS) with a scan path perpendicular to the membrane plane was introduced to measure diffusion and interactions of fluorescent components in free standing biomembranes. Using a confocal laser scanning microscope (CLSM) the open detection volume is moved laterally with kHz frequency through the membrane and the photon events are continuously recorded and stored in a file. While the accessory hardware requirements for a conventional CLSM are minimal, data evaluation can pose a bottleneck. The photon events must be assigned to each scan, in which the maximum signal intensities have to be detected, binned, and aligned between the scans, in order to derive the membrane related intensity fluctuations of one spot. Finally, this time-dependent signal must be correlated and evaluated by well known FCS model functions. Here we provide two platform independent, open source software tools (PyScanFCS and PyCorrFit) that allow to perform all of these steps and to establish perpendicular SFCS in its one- or two-focus as well as its single- or dual-colour modality.

研究の動機と目的

• 動的バイオ膜を研究する際、従来の一点FCSで生じる運動に起因するアーチファクトや光不活性化の課題に対処すること。
• 膜面に垂直なスキャンを用いて、巨大単層膜小胞（GUVs）における膜拡散およびタンパク質相互作用の高精度測定を可能にすること。
• 垂直スキャンパスを用いたSFCSのための、堅牢でオープンソースかつプラットフォーム非依存のデータ解析パイプラインを提供すること。
• 多様な膜バイオフィジックス応用に適した、ワンフォーカスおよびツーフォーカス、シングルカラーバリューカラーの両方のSFCSモダリティを容易にすること。

提案手法

• 共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）を用いて、膜面に垂直な方向にkHz周波数で横方向スキャンを行い、光子イベントは時間相関単一光子計数（TCSPC）により記録する。
• PyScanFCSを用いて、光子到着時刻の高速フーリエ変換（FFT）によりスキャンサイクル時間を検出し、複数回のスキャンからの強度トレースをkymographにアラインメントして可視化する。
• ビニング処理および不活性化補正を施し、スキャンパスに沿った膜特異的な強度揺らぎを抽出する。
• 複数τアルゴリズムを用いて、アラインメント済みトレースからの時間相関強度揺らぎを計算する。
• PyCorrFitを用いて、相関曲線を標準FCSモデル関数にフィットさせ、拡散時間、拡散係数、粒子数を抽出する。
• ユーザー定義のモデル関数をサポートし、共有パラメータを持つ複数データセットのグローバルフィッティングを可能にする。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 測定後に行うスキャンアラインメントを用いた垂直SFCSは、GUVsにおける膜の運動やドリフトに起因するアーチファクトを効果的に低減できるか？
• RQ2 膜系において、垂直SFCSの信号対雑音比および測定時間は、従来の一点FCSと比較してどのように異なるか？
• RQ3 Alexa 488を溶液中でキャリブレーション標準として用いた場合、垂直SFCSによる拡散係数の決定精度はどの程度か？
• RQ4 この垂直スキャンアプローチを用いた双色SFCSは、膜内でのタンパク質-タンパク質相互作用を信頼性高く評価できるか？
• RQ5 オープンソースツールであるPyScanFCSおよびPyCorrFitは、異なる研究室間で再現可能でアクセス可能なSFCS解析をどの程度可能にするか？

主な発見

• 本手法は、スキャントレースの測定後アラインメントにより、GUVsにおける運動に起因するアーチファクトを効果的に低減し、膜の移動や形状変化があっても信頼性のある相関解析を可能にする。
• 垂直SFCSは、スキャンサイクルの大部分でレーザー焦点を膜の外に保つことで、光不活性化を低減し、時間経過に伴う信号安定性を向上させる。
• 22°Cの10 mM Trisバッファー中におけるAlexa 488の拡散係数は (4.35 ± 0.1) × 10⁻¹⁰ m²/s と測定され、信頼性の高いキャリブレーション標準として機能する。
• 光子到着時刻のFFTにより決定されるスキャンサイクル時間は、LSMソフトウェアで設定された名目値と異なる場合があり、実験的検証が不可欠である。
• PyCorrFitは、標準FCSモデルへのフィッティングを堅牢に実行でき、複数データセットの共有パラメータを用いたグローバルフィッティングも可能である。
• ソフトウェアパイプラインはユーザー定義のモデル関数をサポートしており、複雑な膜ダイナミクスの高度な解析に柔軟性を提供する。