[論文レビュー] Spatial and temporal dynamics of RhoA activities of single breast tumor cells in a 3D environment revealed by a machine learning-assisted FRET technique

Brian C. H. Cheung, Louis Hodgson+2 more|arXiv (Cornell University)|Sep 29, 2021

Cellular Mechanics and Interactions参考文献 78被引用数 11

ひとこと要約

本研究では、2次元および3次元環境で移動する単一のMDA-MB-231乳がん細胞におけるRhoA活性の時空間的ダイナミクスをマップするため、機械学習支援FRET技術を導入した。U-Netニューラルネットワークを用いた正確な細胞セグメンテーションにより、2次元ではRhoA活性が前後方向に極性を示し、明著な周期的ダイナミクスを示す一方、3次元では極性を示さず、速度とは相関が薄いが、両者で細胞の伸長と強く関連していることが明らかになった。

ABSTRACT

One of the hallmarks of cancer cells is their exceptional ability to migrate within the extracellular matrix (ECM) for gaining access to the circulatory system, a critical step of cancer metastasis. RhoA, a small GTPase, is known to be a key molecular switch that toggles between actomyosin contractility and lamellipodial protrusion during cell migration. Current understanding of RhoA activity in cell migration has been largely derived from studies of cells plated on a two-dimensional (2D) substrate using a FRET biosensor. There has been increasing evidence that cells behave differently in a more physiologically relevant three-dimensional (3D) environment, however, studies of RhoA activities in 3D have been hindered by low signal-to-noise ratio in fluorescence imaging. In this paper, we present a machine learning-assisted FRET technique to follow the spatiotemporal dynamics of RhoA activities of single breast tumor cells (MDA-MB-231) migrating in a 3D as well as a 2D environment using a RhoA biosensor. We found that RhoA activity is more polarized along the long axis of the cell for single cells migrating on 2D fibronectin-coated glass versus those embedded in 3D collagen matrices. In particular, RhoA activities of cells in 2D exhibit a distinct front-to-back and back-to-front movement during migration in contrast to those in 3D. Finally, regardless of dimensionality, RhoA polarization is found to be correlated with cell shape.

研究の動機と目的

• 3次元FRETイメージングにおけるRhoA活性の低SN比を克服すること。
• ライブ細胞のFRETおよびCFP画像ペアを自動的にセグメンテーションする、堅牢で自動化された手法を開発すること。
• 2次元および3次元の細胞外マトリックス内を移動する単一のMDA-MB-231細胞におけるRhoA活性の時空間的ダイナミクスを比較すること。
• 両環境下でのRhoA極性、細胞形態、および移動速度との関係を調査すること。

提案手法

• ライブ細胞内で活性RhoA（GTP結合型）を比測定可能とする遺伝子コード化、シングルチェーンFRETバイオセンサー（RhoA FLARE.sc）を用いた。
• FRETおよびCFP蛍光画像からの細胞輪郭の正確な自動セグメンテーションを実行するため、U-Net畳み込みニューラルネットワークを適用した。
• アフィン変換およびビードベースの画像登録を用い、FRETおよびCFPチャネルをサブピクセル精度（登録後0.045 µmのずれ）で整合させた。
• 細胞重心からの強度加重移動ベクトルのベクトル和を用いてRhoA極性を計算した。
• RaoのスパACING検定を用い、RhoA極性の方向性バイアス（細胞速度に対する相対的）を評価した。
• スピアマン順位相関を用い、極性強度、細胞の縦横比、および移動速度との関係を定量した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 2次元と3次元の移動環境におけるRhoA活性の空間的・時間的差異は何か？
• RQ2 2次元と3次元の両環境で、RhoA極性は細胞の長軸とどの程度一致しているか？
• RQ3 2次元および3次元環境下で、RhoA極性は細胞速度と相関しているか？
• RQ4 3次元および2次元環境下で、RhoA極性は細胞形態（縦横比）とどのように関連しているか？
• RQ5 RhoA活性は2次元および3次元環境で周期的振動を示すか？

主な発見

• 2次元環境ではRhoA活性が前後方向および後方から前方への周期的ダイナミクスを示すが、3次元環境では極性を示さず、空間的に不均一な分布を示す。
• 2次元環境ではRhoA極性が細胞の長軸と顕著に一致する（平均コサイン値 = 0.82）が、3次元環境ではそれより弱い（平均コサイン値 = 0.65）、p < 0.001。
• 2次元（ρ = 0.58）および3次元（ρ = 0.42）の両環境で、RhoA極性強度は細胞の縦横比と正のスピアマン相関を示す（p < 0.0001）。
• 2次元環境では細胞の移動速度が顕著に速い（平均速度 = 1.8 µm/min）が、3次元環境では遅い（平均速度 = 0.9 µm/min）であり、両環境で速度と極性との間に有意な相関は認められない。
• 2次元環境ではRhoA極性に約30分の主要周期の周期的振動が一部の細胞で観察されるが、3次元環境では同様の周期性は観察されない。
• RaoのスパACING検定により、2次元環境ではRhoA極性が細胞速度に対して強く反対方向に配置されている（ピークが180°、p < 0.0001）が、3次元環境では特定の角度関係は認められない（p = 0.5000）。