[論文レビュー] The effects of subdiffusion on the NTA size measurements of extracellular vesicles in biological samples

M. Majka, Martyna Durak-Kozica+4 more|arXiv (Cornell University)|Jan 31, 2017

Fractional Differential Equations Solutions参考文献 11被引用数 4

ひとこと要約

本論文は、異常（準拡散的）な粒子運動のため、系統的に過大評価されるが、細胞外小胞（EV）のNTAサイズ測定を補正する対数的準拡散モデルを提案する。標準のストークス＝アインシュタイン仮定（線形平均二乗変位MSD ∝ t）を、準拡散的モデル（MSD ∝ t^α、0 < α < 1）に置き換えることで、通常の拡散モデルと比較して平均EVサイズ推定値を約50％低減し、AFMデータとより整合性の高い結果を得た。

ABSTRACT

The interest in the extracellular vesicles (EVs) is rapidly growing as they became reliable biomarkers for many diseases. For this reason, fast and accurate techniques of EVs size characterization are the matter of utmost importance. One increasingly popular technique is the Nanoparticle Tracking Analysis (NTA), in which the diameters of EVs are calculated from their diffusion constants. The crucial assumption here is that the diffusion in NTA follows the Stokes-Einstein relation, i.e. that the Mean Square Displacement (MSD) of a particle grows linearly in time (MSD $\propto t$). However, we show that NTA violates this assumption in both artificial and biological samples, i.e. a large population of particles show a strongly sub-diffusive behaviour (MSD $\propto t^α$, $0

研究の動機と目的

• NTAにおける細胞外小胞（EV）サイズの系統的過大評価を、準拡散的粒子運動の影響によって是正すること。
• 長年の懸案事項であるNTAとAFMなどの直接画像法との間の差異（2～4倍の乖離）を解消すること。
• 多分散の生物学的サンプルにおいて、不適切なアーチファクトを生じさせることなく、準拡散を考慮した堅牢でデータ駆動型のNTA解析プロトコルを開発すること。
• 一般化された拡散定数と粒子サイズの関係を明確に示す、実用的で解析的に取り扱いやすいモデルを提供すること。
• AFM測定と比較して、本モデルの正確性と分布形状の再現性を検証し、標準NTAおよび有限軌跡長補正（FTLA）を上回ることを示すこと。

提案手法

• NTAの平均二乗変位（MSD）軌跡を分析し、ポリスチレンビーズおよび生物学的EVサンプルの両方で、準拡散的挙動（MSD ∝ t^α、0 < α < 1）を検出する。
• 一般化された拡散係数と粒子径の関係を記述する対数的準拡散モデルを提案し、異常拡散下での粒子サイズ推定を可能にする。
• 患者由来EVサンプル（P1、P2、P3）のNTAデータに本モデルを適用し、標準のストークス＝アインシュタイン仮定を準拡散的運動に置き換える。
• 標準NTA（通常の拡散）、FTLA、およびAFM測定結果と比較して、正確性と分布形状の妥当性を検証する。
• 非拡散的または非定常的軌跡を除外するためのデータ選別プロトコルを実装し、信頼性の高いMSDフィッティングを確保する。
• AFMをゴールドスタンダードの基準として用い、サイズ分布の妥当性を裏付けるとともに、各手法間の乖離を評価する。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 NTAにおける準拡散的運動が、線形MSD対時間関係（ストークス＝アインシュタイン仮定）をどの程度破り、EVサイズ推定にどのような影響を及えるか？
• RQ2 FTLAが失敗する多分散的・生物学的に複雑なサンプルにおいて、準拡散モデルがEVサイズ分布を正確に再構築できるか？
• RQ3 NTAとAFMのサイズ測定値の乖離は、さまざまなEVサンプルでどのようにスケーリングされるか？そして、これは異常拡散によってのみ説明可能か？
• RQ4 提案された対数的準拡散モデルは、標準NTAと比較してEVサイズの過大評価を低減するか？また、FTLAと比較して優れているか？
• RQ5 FTLAは高多分散サンプルにおいてどのような限界を示すか？そして、準拡散モデリングはより信頼性の高い代替手法となり得るか？

主な発見

• 人工的および生物学的EVサンプルの両方で、準拡散的挙動（MSD ∝ t^α、0 < α < 1）が顕著に認められ、標準NTAの線形MSD仮定が破綻していることが判明した。
• 提案された対数的準拡散モデルにより、標準のストークス＝アインシュタインに基づく解析と比較して、NTAによるEV径の平均推定値が約50％低減された。
• 小さな粒子（約200 nm）では、準拡散モデルの精度が最新のFTLA手法と同等の水準に達した。
• 準拡散モデルは、AFMデータと形状と平均径の両面で良好に一致するサイズ分布を生成し、P1、P2、P3の平均径はそれぞれ223 nm、155 nm、143 nmであった。
• 一方、標準NTAはAFMと比較してEVサイズを4.0～5.5倍も過大評価しており、深刻な系統的バイアスが存在することが示された。
• FTLAはAFMデータと一致しない不自然な複数ピークを生じさせる一方、準拡散モデルはこのような歪みを回避した。