[論文レビュー] Pulmonary surfactant inhibition of nanoparticle uptake by alveolar epithelial cells

Milad Radiom, Matthieu Sarkis+4 more|arXiv (Cornell University)|Oct 20, 2020

Inhalation and Respiratory Drug Delivery参考文献 55被引用数 64

ひとこと要約

本研究では、肺線溶性物質がアルベオラ上皮細胞（A549およびNCI-H441）による陽性に charged なシリカナノ粒子の取り込みを顕著に低下させ、内部化を最大で2桁減少させることを示した。ガラスカバーソリューションおよびエア・リキッド界面トランスウェルを用いたin vitroモデルにおいて、研究者たちは線溶性物質がナノ粒子と保護的集合体を形成し、細胞への相互作用と取り込みを低減することを示した。これは蛍光および共焦点顕微鏡による確認で、細胞内でのナノ粒子とリピッドビキュールのコローカライゼーションが得られた。

ABSTRACT

Pulmonary surfactant forms a sub-micrometer thick fluid layer that covers the surface of alveolar lumen and inhaled nanoparticles therefore come in to contact with surfactant prior to any interaction with epithelial cells. We investigate the role of the surfactant as a protective physical barrier by modeling the interactions using silica-Curosurf-alveolar epithelial cell system in vitro. Electron microscopy displays that the vesicles are preserved in the presence of nanoparticles while nanoparticle-lipid interaction leads to the formation of mixed aggregates. Fluorescence microscopy reveals that the surfactant decreases the uptake of nanoparticles by up to two orders of magnitude in two models of alveolar epithelial cells, A549 and NCI-H441, irrespective of immersed culture on glass or air-liquid interface culture on transwell. Confocal microscopy corroborates the results by showing nanoparticle-lipid colocalization interacting with the cells. Our work thus supports the idea that pulmonary surfactant plays a protective role against inhaled nanoparticles. The effect of surfactant should therefore be considered in predictive assessment of nanoparticle toxicity or drug nanocarrier uptake. Models based on the one presented in this work may be used for preclinical tests with engineered nanoparticles.

研究の動機と目的

• 吸入されたナノ粒子に対するアルベオラ領域における肺線溶性物質の物理的バリアとしての役割を調査すること。
• 線溶性物質が2つのアルベオラ上皮細胞モデル（A549およびNCI-H441）におけるナノ粒子取り込みに与える影響を評価すること。
• 標準的培養条件（ガラスカバーソリューション）とエア・リキッド界面（トランスウェル）の条件を比較し、生理的関連性を評価すること。
• 線溶性物質とリピッドの相互作用が、ナノ粒子の沈降および有効な細胞内投与量に与える影響を特定すること。
• 線溶性物質濃度がナノ粒子-細胞相互作用および取り込み効率に与える影響を評価すること。

提案手法

• Curosurf®（臨床的線溶性物質代替品）と陽性に charged なアミノ修飾シリカナノ粒子を組み合わせたモデル系を用いた。
• A549およびNCI-H441細胞をガラスカバーソリューションおよびエア・リキッド界面条件のトランスウェル上に培養し、露出実験を実施した。
• 時間経過に伴う蛍光強度の測定により、蛍光顕微鏡を用いてナノ粒子取り込みを定量した。
• 共焦点顕微鏡を用いて、蛍光標識ナノ粒子とリピッド標識線溶性物質ビキュールの細胞内コローカライゼーションを分析した。
• 透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて、ナノ粒子-線溶性物質相互作用およびリピッド包み構造内への内部化を可視化した。
• 動的光散乱（DLS）を測定し、線溶性物質存在下でのナノ粒子凝集および水動的サイズ変化を評価した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 肺線溶性物質は、アルベオラ上皮細胞による陽性に charged なシリカナノ粒子の取り込みにどのように影響を与えるか？
• RQ2 線溶性物質の存在が、ナノ粒子の沈降プロファイルまたは上皮細胞への有効投与量に影響を与えるか？
• RQ3 異なる培養モデル（ガラス対トランスウェル）は、線溶性物質存在下でのナノ粒子取り込みにどのように影響を与えるか？
• RQ4 線溶性物質-リピッド集合体がナノ粒子内部化をどの程度低減させ、その効果は用量依存的か？
• RQ5 線溶性物質存在下で、A549とNCI-H441細胞の間でナノ粒子取り込みに差があるか？

主な発見

• 肺線溶性物質は、培養基質や界面条件に関係なく、A549およびNCI-H441細胞両方において、ナノ粒子取り込みを最大で2桁まで低下させた。
• Curosurf® とナノ粒子の混合比 X = 2 のとき、取り込みは対照（ナノ粒子単体）の1.5–2.1%にまで低下したが、X = 20 ではさらなる低下は認められなかった。
• 共焦点顕微鏡により、細胞内でのナノ粒子と線溶性物質リピッドのコローカライゼーションが確認され、線溶性物質が取り込みを調節する直接的関与が示された。
• TEM像では、ナノ粒子が線溶性物質ビキュールと混合集合体を形成し、リピッド包み構造内に内部化されていることが観察された。
• NCI-H441細胞はA549細胞よりも取り込みが低く、トランスウェル条件ではわずか2%の粒子が内部化された。これは、密接接合による内在的保護能の優位性を示唆している。
• 線溶性物質-リピッド複合体はナノ粒子の沈降を変化させ、おそらくビキュールと密度が一致するため、有効な細胞露出が低下したと考えられる。