[論文レビュー] Structured illumination fluorescence microscopy using Talbot self-imaging effect for high-throughput visualization

Shwetadwip Chowdhury, Jeffrey Chen+1 more|arXiv (Cornell University)|Jan 10, 2018

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques参考文献 12被引用数 6

ひとこと要約

本論文は、顕微鏡の対物レンズの数値孔径（NA）に制限されない大面積で、回折限界を下回る分解能を持つパターンを生成するために、タロブ自己像像効果を活用した新しい構造的照明顕微鏡（SIM）手法を提示している。特許取得済みの周期的構造的要素をタロブ距離の整数倍の位置に配置することで、450 × 350 µmの視野で500 nmの分解能を達成した。これは、顕微鏡の対物レンズの回折限界2 µmを4倍改善した結果であり、高スルーレットの超解像蛍光顕微鏡が可能になる。

ABSTRACT

We report a novel extension to structured illumination (SI) microscopy that utilizes the Talbot self-imaging effect to generate a SI pattern on a sample with field-of-view (FOV) and resolution unconstrained by the numerical aperture (NA) of the microscope objective. This enables high-resolution SI pattern generation (up to the free-space propagation limit) across large FOVs, which in turn allows SI microscopy to be efficiently adapted for high-throughput imaging. We demonstrated this concept using a simple prototype microscope to image a large FOV (450 x 350 um) with a diffraction-limited fluorescence resolution limited by the microscope NA to 2 um. A custom-fabricated structured element, designed with periodic spatial features beyond the diffraction limit of the microscope imaging objective, was positioned to within an integer multiple of half the Talbot distance away from the sample. This generated a large FOV, sub-diffraction SI pattern at the sample plane via the Talbot self-imaging effect. Conventional SI super-resolution principles were then used to increase imaging resolution to 500 nm across the complete FOV, roughly a factor of 4 improvement over the microscope NA diffraction limit. This approach should also be applicable for high-throughput sub-diffraction resolution multimodal imaging.

研究の動機と目的

• 従来の顕微鏡対物レンズの数値孔径（NA）が引き起こす視野と分解能の制限を克服すること。
• 大面積で回折限界を下回る分解能を持つ構造的照明パターンを生成することで、高スルーレットの超解像蛍光顕微鏡を実現すること。
• タロブ自己像像効果を活用して、像の撮影対物レンズの回折限界を超えた空間周波数成分を照明パターンに拡張すること。
• この手法の実用的でプロトタイプベースの実装を提示し、大視野で定量的な分解能向上を示すこと。

提案手法

• 顕微鏡対物レンズの回折限界を下回る周期的空間特徴を持つカスタム製造の構造的要素を用いて、周期的な照明パターンを生成する。
• 構造的要素をサンプル面からタロブ距離の半分の整数倍の位置に配置することで、タロブ自己像像効果を励起する。
• タロブ効果により、サンプル面上に自己複製され、高空間周波数の干渉パターンが生成され、大視野にわたる構造的照明が可能になる。
• 自己像像効果により、対物レンズのNAに依存せずに、全視野にわたって回折限界を下回る分解能を持つパターンが生成される。
• 得られた画像に従来のSIM再構成アルゴリズムを適用することで、回折限界を超えた超解像が達成される。
• 2 µmの回折限界を持つ対物レンズを搭載した簡易プロトタイプ顕微鏡を用いて、実験的に妥当性を検証した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 タロブ自己像像効果を用いて、蛍光顕微鏡で大面積かつ回折限界を下回る分解能を持つ構造的照明パターンを生成できるか？
• RQ2 このアプローチは、顕微鏡対物レンズの数値孔径が引き起こす視野と分解能の制約を克服できるか？
• RQ3 この手法は、高NAの対物レンズを必要とせず、大視野（例：450 × 350 µm）で一貫した超解像像（例：500 nm）を達成できるか？
• RQ4 タロブに基づく構造的照明法は、蛍光顕微鏡における高スルーレットイメージング応用と互換性があるか？
• RQ5 この手法は、マルチモードで高スルーレットの回折限界を下回る分解能イメージングに拡張可能か？

主な発見

• タロブ自己像像効果により、450 × 350 µmの視野にわたって大面積かつ回折限界を下回る分解能を持つ構造的照明パターンが成功裏に生成された。
• 全視野にわたって500 nmの分解能が達成され、顕微鏡対物レンズの回折限界2 µmを4倍改善した。
• 対物レンズの数値孔径を増加させることなく、周期的構造的要素の自己像像効果に依存することで分解能向上が達成された。
• 構造的要素は、像の撮影対物レンズの回折限界を下回る特徴を有するように製造され、高空間周波数パターンの生成が可能になった。
• 自己像像効果は、タロブ距離の半分の整数倍の位置で観察され、この手法の理論的基盤が確認された。
• 対物レンズのNAに依存しない分解能の実現により、高スルーレットの超解像蛍光顕微鏡の実現可能性が示された。