[論文レビュー] Sub-100 nm 3-D fluorescence lifetime imaging using time correlated single photon counting detection and multifocal multiphoton excitation

Sunil Kumar|Figshare|Jan 1, 2017

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques参考文献 37被引用数 17

ひとこと要約

本論文では、時間相関単一光子カウント（TCSPC）とマルチフォーカルマルチフォトン励起を組み合わせることで、100 nm未塔の空間分解能を達成する3次元フラーレンス寿命イメージング技術を提示している。この手法により、信号対雑音比が向上し、光傷害が低減される高精度な3次元寿命測定が、生物学的標本において可能になる。

ABSTRACT

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研究の動機と目的

• フラーレンス寿命イメージングにおける100 nm未塔の3次元空間分解能を達成すること。
• 従来のマルチフォトン顕微鏡における深さ方向および横方向分解能の限界を克服すること。
• 局所的励起により、生細胞イメージングにおける光傷害および光酸化を低減すること。
• 時間相関単一光子カウントを用いて信号対雑音比と時間分解能を向上させること。
• 高精度な空間分解能と時間分解能を備えた、複雑な生物学的標本における定量的3次元寿命測定を可能にすること。

提案手法

• 同時に複数の励起スポットを生成するマルチフォーカルマルチフォトン励起を用い、イメージング速度と信号収集効率を向上させる。
• フラーレンス減衰時間の正確な測定に時間相関単一光子カウント（TCSPC）を採用する。
• TCSPCと高精度なタイミングシステムを組み合わせ、ナノ秒スケールのフラーレンス寿命を解像可能にする。
• マルチフォーカスアレイを用いた3次元走査戦略を適用し、100 nm未塔の分解能を達成するボリュームイメージングを実現する。
• 焦点外の蛍光を排除し軸方向分解能を向上させるために共焦点検出方式を採用する。
• ヒストグラム処理システムと高感度単一光子検出器を統合し、寿命再構築を実現する。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 TCSPCとマルチフォーカル励起を用いることで、100 nm未塔の3次元空間分解能をフラーレンス寿命イメージングで達成できるか？
• RQ2 従来の単一スポット励起と比較して、マルチフォーカルマルチフォトン励起は信号対雑音比とイメージング速度をどのように向上させるか？
• RQ3 この技術は、生細胞標本における光傷害および光酸化をどの程度低減するか？
• RQ4 この装置を用いた3次元寿命測定における軸方向および横方向分解能は、どの程度達成可能か？
• RQ5 この手法は、細胞小器官の微細構造を、そのフラーレンス寿命の差異に基づいて解像できるか？

主な発見

• 本技術は、3次元フラーレンス寿命イメージングにおいて、横方向および軸方向に100 nm未塔の分解能を達成した。
• 時間相関単一光子カウントを用いることで、ナノ秒スケールの精度でフラーレンス寿命測定が可能となった。
• マルチフォーカル励起により信号収集効率が向上し、より高速なボリュームイメージングが実現した。
• 単一スポットマルチフォトン顕微鏡と比較して、光傷害および光酸化が顕著に低減された。
• 高空間・時間分解能を備えた、生物学的標本における定量的3次元寿命マッピングが可能となった。
• 生物学的標本を用いた検証により、細胞小器官のイメージングに適した分解能と感度を示した。