[논문 리뷰] Instant determination of the potential biomarker heparan sulfate in human plasma by a mix-and-read fluorescence assay

Ulrich Warttinger, Roland Krämer|arXiv (Cornell University)|2017. 02. 17.

Proteoglycans and glycosaminoglycans research참고 문헌 14인용 수 4

한 줄 요약

이 연구는 헤파린 레드 키트를 사용하여 인간 혈장 내 헤파란 술포산(HS)을 샘플 전처리 없이 즉각적으로 정량화할 수 있는 빠르고 믹스-온-리드 형광 분석법을 제시한다. 이 방법은 저미크로그램/밀리리터 수준에서 높은 감도를 보이며, ELISA나 디사카라이드 분석과 같은 시간이 오래 걸리는 전통적 방법에 비해 크게 향상되었으며, 만성숙산증후군 및 패혈성 쇼크와 같은 질환에서 생체지표로의 임상적 응용 가능성이 높다.

ABSTRACT

Heparan sulfate (HS) is a linear, polydisperse sulfated polysaccharide belonging to the glycosaminoglycan family. HS proteoglycans are ubiquitously found at the cell surface and extracellular matrix in animal species. HS is involved in the interaction with a wide variety of proteins and the regulation of many biological activities. In certain pathologic conditions, expression and shedding of HS proteoglycans is overregulated, or enzymatic degradation of HS in lysosomes is deficient, both leading to excess circulating free HS chains in blood plasma. HS has therefore been suggested as a biomarker for various severe disease states. The structural heterogeneity makes the quantification of heparan sulfate in complex matrices such as human plasma challenging. HS plasma levels are usually quantified by either disaccharide analysis or enzyme linked immunosorbent assay(ELISA). Both methods require time-consuming multistep-protocols. We describe here the instant detection of heparan sulfate in spiked plasma samples by the Heparin Red Kit, a commercial mix-and-read fluorescence microplate assay. The method enables HS quantification in the low microgram per mL range without sample pretreatment. Heparin Red appears to be sufficiently sensitive for the detection of highly elevated HS levels as reported for mucopolysaccharidosis, graft versus host disease after transplantation, dengue infection or septic shock. This study is a significant step toward the development of a convenient and fast method for the quantification of HS in human plasma, with the potential to simplify the detection and advance the acceptance of HS as a biomarker.

연구 동기 및 목표

• 심각한 질환의 잠재적 생체지표로 인간 혈장 내 헤파란 술포산(HS)을 정량화하기 위한 빠르고 편리한 방법을 개발하는 것.
• 기존의 HS 정량 방법이 시간이 오래 걸리고 여러 단계를 필요로 하는 한계를 극복하는 것.
• 헤파린 레드 키트의 감도와 임상 혈장 샘플에서 높아진 HS 농도를 검출하는 데의 적용 가능성을 평가하는 것.
• 임상 진단 및 생체지표 검증에 적합한 간소화되고 고 throughput인 접근법을 수립하는 것.

제안 방법

• 헤파린 레드 키트를 사용하여 인간 혈장 샘플에 혈액을 첨가한 상태에서 직접 헤파란 술포산을 검출하기 위한 상용 믹스-온-리드 형광 마이크로플레이트 분석법을 활용하였다.
• 샘플 전처리 없이 시행하여 준비 단계를 최소화하고 분석 시간을 단축시켰다.
• 표준 곡선 캘리브레이션 기반으로 형광 강도를 측정하여 HS 농도를 정량하였다.
• 저미크로그램/밀리리터 범위에서 복원도, 정밀도 및 선형성을 평가하기 위해 혈액에 첨가한 샘플을 이용해 방법을 검증하였다.
• 기존의 방법인 ELISA 및 디사카라이드 분석과의 성능을 비교하였다.
• 만성숙산증후군 및 패혈성 쇼크와 같은 병리 상태에서 매우 높은 수준의 HS를 검출할 수 있는 감도를 평가하였다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 믹스-온-리드 형광 분석법은 샘플 전처리 없이 인간 혈장 내 헤파란 술포산을 검출할 수 있는가?
• RQ2 헤파린 레드 키트는 혈장 내 임상적으로 관련성이 있는 수준의 헤파란 술포산을 검출하는 데 얼마나 감도가 높은가?
• RQ3 기존의 방법인 ELISA나 디사카라이드 분석과 비교해 이 분석법은 신뢰성 있고 재현 가능한 HS 정량을 제공하는가?
• RQ4 이 방법은 만성숙산증후군 또는 패혈성 쇼크와 같이 혈장 내 HS 농도가 높아지는 상태에서 HS를 검출하는 데 적용될 수 있는가?
• RQ5 헤파린 레드 분석법은 생체지표 검출 플랫폼으로서 고 throughput 임상 적용에 적합한가?

주요 결과

• 헤파린 레드 분석법은 샘플 전처리 없이 인간 혈장 내 헤파란 술포산을 즉각적으로 검출할 수 있었으며, 분석 시간을 크게 단축시켰다.
• 이 방법은 심각한 질환에서 관찰되는 매우 높은 수준의 HS를 식별할 수 있는 저미크로그램/밀리리터 범위에서 높은 감도를 보였다.
• 첨가한 혈장 샘플에서의 복원도는 테스트 농도 범위 전반에서 높은 정확성과 신뢰성을 나타내었다.
• 이 분석법은 만성숙산증후군, 이식대병원병, 뎅기열 감염 및 패혈성 쇼크와 같은 병리 상태에서 HS를 검출할 잠재력이 높았다.
• 믹스-온-리드 형식은 워크플로우를 단순화하고 고 throughput 스크리닝을 지원하여 임상 적용 가능성 향상에 기여하였다.
• 본 연구는 헤파린 레드 키트가 복잡한 생물학적 기질에서 기존의 수작업이 많은 방법에 비해 실용적인 대안이 될 수 있음을 확인하였다.