[論文レビュー] Spectro-temporal encoded Multiphoton Microscopy

Sebastian Karpf, Carson T. Riche+6 more|arXiv (Cornell University)|Sep 2, 2017

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques参考文献 46被引用数 12

ひとこと要約

本論文では、パルス変調された波長スイープレーザーと角度分散を用いた慣性のないビームスキャニングにより、キロヘルツフレームレートを達成するスペクトル時間符号化マルチフォトン顕微鏡を提案する。これにより、秒間8800万ピクセルの蛍光寿命イメージングが可能となり、画像支援細胞選別への応用を想定した回折限界の高感度でマルチモード2光子蛍光およびFLIMを実現する高速・高スルーレットなイメージングが可能となる。

ABSTRACT

Two-Photon Microscopy has become an invaluable tool for biological and medical research, providing high sensitivity, molecular specificity, inherent three-dimensional sub-cellular resolution and deep tissue penetration. In terms of imaging speeds, however, mechanical scanners still limit the acquisition rates to typically 10-100 frames per second. Here we present a high-speed non-linear microscope achieving kilohertz frame rates by employing pulse-modulated, rapidly wavelength-swept lasers and inertia-free beam steering through angular dispersion. In combination with a high bandwidth, single-photon sensitive detector, we achieve recording of fluorescent lifetimes at unprecedented speeds of 88 million pixels per second. We show diffraction-limited, multi-modal, Two-Photon fluorescence and fluorescence lifetime (FLIM), microscopy and imaging flow cytometry with a digitally reconfigurable laser, imaging system and data acquisition system. These unprecedented speeds should enable high-speed and high-throughput image-assisted cell sorting.

研究の動機と目的

• 従来の2光子顕微鏡の速度制限を克服すること。これは、機械的スキャナーに起因し、通常10～100フレーム/秒が上限である。
• 画像支援細胞選別などの高度な生物学的応用を想定した高速・高スルーレットなイメージングを可能とすること。
• 画質限界の高分解能で、マルチモード2光子蛍光および蛍光寿命イメージング（FLIM）を、前例のない高速度で取得できるシステムの開発。
• デジタルで再構成可能なレーザー、イメージングシステム、データ取得パイプラインを統合し、柔軟で高帯域幅の運用を可能とすること。

提案手法

• パルス変調された高速波長スイープレーザーを用いて、超高速でスペクトル符号化された励起パルスを生成する。
• 慣性のないビームスキャニングを実現するため、角度分散を用いる。これにより、機械的スキャン遅延が解消される。
• 高帯域幅で単一光子に感度のある検出器を統合し、高時間分解能で蛍光信号を捕捉する。
• スペクトル時間符号化を適用し、時間と波長にわたって空間的およびスペクトル的情報を多重化する。
• デジタルで再構成可能なシステムアーキテクチャを採用し、レーザーのパrameter、イメージングモード、データ取得設定の動的調整が可能となる。
• 波長スイープ励起と時間分解検出を組み合わせることで、高フレームレートで蛍光寿命測定を実現する。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 スペクトル時間符号化と波長スイープレーザーを用いることで、機械的スキャンの制限を超えてキロヘルツフレームレートを達成できるか？
• RQ2 この手法を用いた蛍光寿命イメージングで、得られる最大のピクセル取得レートは何か？
• RQ3 このシステムは、マルチモード2光子蛍光およびFLIMイメージングを実現しつつ、回折限界の分解能を維持できるか？
• RQ4 慣性のないビームスキャニング機構は、従来のガルバノメータスキャナーと比較して、イメージング速度と安定性をどのように向上させるか？
• RQ5 このシステムは、多様なイメージングタスクと高スルーレットな応用に適応できる程度に、どの程度デジタルで再構成可能か？

主な発見

• 本システムは、記録的な蛍光寿命イメージング速度を達成し、秒間8800万ピクセルにのぼる。これは従来の制限を著しく上回る。
• 角度分散による慣性のないビームスキャニングを用いることで、キロヘルツフレームレートが実証され、機械的スキャン遅延が完全に排除された。
• 高感度と分子特異性を備えた、回折限界のマルチモード2光子蛍光および蛍光寿命イメージング（FLIM）が達成された。
• 高速スキャンと高帯域幅検出を組み合わせることで、高スルーレットなイメージングフローサイトメトリーが可能となった。
• デジタルで再構成可能なレーザー、イメージング、データ取得システムにより、多様な生物学的イメージングタスクへの柔軟な適応が可能となった。
• 本手法は、画像支援細胞選別応用に適した高速・高感度・高分解能のイメージングを実現する。