[논문 리뷰] Comparison of Heparin Red, Azure A and Toluidine Blue assays for direct quantification of heparins in human plasma

Ulrich Warttinger, Christina Giese외 1명|arXiv (Cornell University)|2017. 12. 09.

Proteoglycans and glycosaminoglycans research참고 문헌 13인용 수 6

한 줄 요약

이 연구는 인간 혈장에서 비분획화 헤파린과 엑소나파린의 직접 정량을 위한 세 가지 양이온 염료 기반 분석법—헤파린 레드, 에이즈어 A, 톨루이딘蓝图—을 평가한다. 헤파린 레드가 다른 것들보다 뛰어나며, 임상적으로 관련성이 있는 범위인 1 IU/mL 이하에서 신뢰할 수 있는 정량이 가능하고, 최소 9배 높은 감도를 보이며, 에이즈어 A와 톨루이딘 블루는 이 범위에서 실패한다.

ABSTRACT

Heparins are are sulfated polysaccharides that have tremendous clinical importance as anticoagulant drugs. Monitoring of heparin blood levels can improve patient safety. In clinical practice, heparins are monitored indirectly by their inhibtory effect on coagulation proteases. Drawbacks of these established methods have stimulated the development of simple direct detection methods with cationic dyes that change absorbance or fluorescence upon binding of polyanionic heparin. Very few such dyes or assay kits, however, are commercially and widely available to a broad community of researchers and clinicians. This study compares the performance of three commercial dyes for the direct quantification of unfractionated heparin and the widely used low-molecular-weight heparin enoxaparin. Two traditional metachromatic dyes, Azure A and Toluidine Blue, and the more recently developed fluorescent dye Heparin Red were applied in a mix-and-read microplate assay to the same heparin-spiked human plasma samples. In the clinically most relevant concentration range below 1 IU (international units) per mL, only Heparin Red is a useful tool for the determination of both heparins. Heparin Red is at least 9 times more sensitive than the metachromatic dyes which can not reliably quantify the heparins in this concentration range. Unfractionated heparin levels between 2 and 10 IU per mL can be determined by all dyes, Heparin Red being the most sensitive.

연구 동기 및 목표

• 세 가지 상용 양이온 염료 분석법—헤파린 레드, 에이즈어 A, 톨루이딘 블루—이 인간 혈장에서 직접 헤파린 정량에 어떻게 성능을 발휘하는지 평가하기 위해.
• 비분획화 헤파린과 저분자량 헤파린(엑소나파린)을 임상적으로 관련성이 있는 농도 범위인 1 IU/mL 이하에서 신뢰할 수 있는 정량이 가능한 분석법을 특정하기 위해.
• 헤파린을 함유한 인간 혈장에서 사용된 혼합-독취 마이크로플레이트 형식을 통해 각 염료의 감도, 동적 범위, 재현성을 비교하기 위해.
• 간접 응고 기반 분석법의 한계를 피할 수 있는 내구성 있고 직접적인 헤파린 모니터링 방법을 확보하기 위해.

제안 방법

• 모든 세 가지 염료를 동일한 헤파린 혼합된 인간 혈장 시료에 대해 혼합-독취 마이크로플레이트 분석 형식을 사용하여 시험하였다.
• 헤파린 레드는 헤파린의 다음성 음이온과 결합할 때 형광 강도가 증가하는 방식으로 헤파린를 검출하기 위해 사용되었다.
• 에이즈어 A와 톨루이딘 블루는 다음성 염색체 염료로서, 헤파린와 결합할 때 흡광도 변화를 이용해 헤파린를 검출하기 위해 사용되었다.
• 시험한 헤파린 농도에는 임상적으로 관련성이 있는 1 IU/mL 이하의 범위와 최대 10 IU/mL까지의 높은 농도가 포함되었다.
• 각 염료에 대해 비분획화 헤파린와 엑소나파린를 사용하여 표준 교정 곡선을 생성하였다.
• 혈장 기반 매트릭스에서 감도 한계, 동적 범위, 재현성에 근거하여 분석 성능을 평가하였다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 헤파린 레드, 에이즈어 A, 톨루이딘 블루는 인간 혈장 내에서 1 IU/mL 이하 농도의 비분획화 헤파린와 엑소나파린를 안정적으로 정량할 수 있는가?
• RQ2 헤파린 레드, 에이즈어 A, 톨루이딘 블루는 혈장 내 헤파린를 검출할 때 감도가 어떻게 비교되는가?
• RQ3 어느 염료 기반 분석법이 임상적으로 관련성이 있는 헤파린 농도 창에서 가장 정확하고 재현성이 높은 정량을 제공하는가?
• RQ4 다음성 염색체 염료(에이즈어 A와 톨루이딘 블루)는 낮은 농도에서 혈장 내 직접 헤파린 모니터링에 충분한 감도를 보이는가?
• RQ5 헤파린 레드는 임상적 헤파린 모니터링을 위한 간접 응고 기반 분석법의 대안으로 유용한가?

주요 결과

• 헤파린 레드는 임상적으로 관련성이 있는 1 IU/mL 이하의 농도 범위에서 에이즈어 A와 톨루이딘 블루보다 최소 9배 높은 감도를 보였다.
• 헤파린 레드만이 인간 혈장 내에서 1 IU/mL 이하 농도의 비분획화 헤파린와 엑소나파린를 안정적으로 정량할 수 있었다.
• 에이즈어 A와 톨루이딘 블루는 1 IU/mL 이하에서 감도가 부족하여 안정적인 정량에 실패했다.
• 헤파린 농도가 2~10 IU/mL 사이일 경우, 세 염료 모두 비분획화 헤파린와 엑소나파린를 정량할 수 있었으며, 헤파린 레드가 가장 높은 감도를 보였다.
• 분석 형식은 내구성이 있었고, 반복 시험에서 일관된 결과를 보여 고속 스크리닝에 적합하였다.
• 헤파린 레드의 형광 기반 검출은 다음성 염료의 흡광도 기반 검출보다 우수한 신호 대 잡음 비율을 제공하였다.