[논문 리뷰] Loss of Cell-Substrate Adhesion Leads to Periodic Shape Oscillations in Fibroblasts

Pramod A. Pullarkat|ArXiv.org|2006. 12. 15.

Cellular Mechanics and Interactions인용 수 7

한 줄 요약

이 연구는 3T3 섬유아세포가 기질에서 분리될 때 액티오미오신 수축성과 칼슘 신호전달에 의해 유도되는 지속적이고 주기적인 형태 변화 진동을 보임을 보여준다. 이러한 진동은 일정한 주파수로 수시간 동안 지속되며, MLCK 및 라오 키나제 경로에 의해 조절되며, 기계적 자극에 의해 활성화되는 칼슘 채널을 통한 외부 칼슘 유입이 진동의 동역학에 필수적임을 밝혀내어, 코어티컬 액티오미오신 젤의 기본적인 기계적 반응임을 규명한다.

ABSTRACT

We report the phenomenon of periodic shape oscillations occurring in 3T3 fibroblasts merely as a consequence of a loss of cell-substrate adhesion. The oscillatory behavior can last many hours at a constant frequency, and can be switched off and on using chemical agents. This robustness allows for the extraction of quantitative data using single cells. We demonstrate that the frequency of oscillations increases with increasing actomyosin contractility. Both the Myosin Light Chain Kinase as well as the Rho Kinase pathways are shown to operate during this process. Further, we reveal significant similarities between the oscillatory dynamics and the commonly observed phenomenon of blebbing. We show that both these processes ceases when extracellular calcium is depleted or when stretch activated calcium channels are blocked. This, along with the fact that these dynamical processes require actomyosin contactility points towards strong similarities in the respective mechanisms. Finally, we speculate on a possible mechanism for the observed dynamical phenomena.

연구 동기 및 목표

• 세포-기질 부착의 손실만으로도 섬유아세포에서 지속적인 형태 변화 진동이 유도되는지 조사하는 것.
• 액티오미오신 수축성과 칼슘 신호전달이 이러한 진동을 유지하는 데 기여하는 역할을 규명하는 것.
• 형태 변화 진동의 동역학을 벨빙 및 기타 세 cytoskeleton 행동과 비교하는 것.
• 약리학적 제제를 사용하지 않은 상태에서 주기적인 형태 변화의 물리적 기전을 탐색하는 것.
• 생체세포 내에서 활성 수축성 젤을 연구하기 위한 단순하고 견고한 모델 시스템을 구축하는 것.

제안 방법

• 세포는 트립신을 사용하거나 부드럽게 흔들어 기질에서 분리하여 유리 바닥 페트리 접시로 이동시켜 부유 상태를 유지하였다.
• 온도 제어(±0.1 °C)를 갖춘 단면형 현미경을 사용하여 실시간으로 형태 변화 동역학을 영상 촬영하였다.
• 이미지 분석을 통해 중심점의 위치나 둘러싸인 면적을 추적하여 진동 주파수와 진폭을 정량화하였다.
• MLCK 및 라오 키나제 억제제를 도입하여 이들 경로가 진동 조절에 미치는 역할을 평가하였다.
• 외부 칼슘 제거 및 기계적 자극에 의해 활성화되는 칼슘 채널 차단제를 사용하여 칼슘 의존성 여부를 검증하였다.
• 선택적 실험에서 EM-CCD를 사용한 형광 영상 촬영을 통해 세 cytoskeleton의 동역학을 모니터링하였다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 약리학적 간섭 없이 기질 부착 없이도 섬유아세포가 주기적인 형태 변화 진동을 보일 수 있는가?
• RQ2 액티오미오신 수축성이 이러한 진동의 주파수를 결정하는 데 기여하는 역할은 무엇인가?
• RQ3 외부 칼슘이 진동의 유도 및 유지에 필수적인가?
• RQ4 형태 변화 진동의 기전은 벨빙과 어떻게 비교되는가?
• RQ5 관찰된 규칙적인 진동 행동을 이끌어내는 액티오미오신 젤의 물리적 특성은 무엇인가?

주요 결과

• 부유 상태의 섬유아세포는 약물 처리 없이도 수시간 동안 일정한 주파수로 지속적인 주기적 형태 변화 진동을 보인다.
• 진동 주파수는 액티오미오신 수축성 증가와 함께 증가하며, MLCK 및 라오 키나제 경로 모두가 미오신 활성화에 기여한다.
• 외부 칼슘 제거 또는 기계적 자극에 의해 활성화되는 칼슘 채널 차단은 진동을 완전히 없애므로 칼슘 유입이 필수적임을 시사한다.
• 형태 변화 진동의 동역학은 특히 칼슘 의존성과 수축 메커니즘에서 벨빙과 유사한 특징을 보이며, 유사성이 뚜렷하다.
• 이 진동 행동은 견고하고 재현 가능하므로, 단일 세포 내에서 활성 수축성 젤을 연구하기 위한 타당한 모델 시스템으로 활용 가능하다.
• 결과적으로 이러한 진동 반응은 섬유아세포의 코어티컬 액티오미오신 젤이 지닌 기본적인 기계적 성질임을 시사한다.