[논문 리뷰] Cryopreservation of sugarcane embryogenic callus using a simplified freezing process

Marcos Edel Martínez-Montero, María Teresa González-Arnao외 3명|arXiv (Cornell University)|2020. 08. 21.

Plant tissue culture and regeneration인용 수 10

한 줄 요약

이 연구는 10% DMSO와 0.3–0.75M 과당 전처리를 거친 제어 냉각 과정을 이용한 단순화된 냉동보존 방법을 사탕무 배아성 콜러스에 적용하여 개발하였다. 이후 0.4–0.6°C/min 속도로 냉각하여 −40°C까지 도달하고 액체 질소에 저장하였다. 이 방법은 최대 94%의 생존율과 완전한 식물편생 재생을 달성하였으며, 14개월 동안의 저장 기간 동안도 안정된 생존율을 유지하였다.

ABSTRACT

A simplified freezing process was developed and successfully applied to embryogenic calluses of three sugarcane commercial hybrids (Saccharum sp. cv. CP 5243, C 91-301 and C 1051-73). To obtain optimal survival, the calluses were pretreated with a cryoprotective solution containing 10% DMSO and 0.3 to 0.75M sucrose. For freezing, the samples were immersed in an alcohol bath placed in a -40 degrees C freezer, thus allowing a freezing rate comprised between 0.4 and 0.6 degrees C/min. Samples were held at that temperature for 2 h before immersion in liquid nitrogen. The highest survival rates of cryopreserved calluses ranged between 20 and 94% depending on the variety, and fully developed plantlets could be obtained from regenerating calluses. Embryogenic calluses of one variety were stored for 14 months in liquid nitrogen without any effect on their survival rate and plantlet production.

연구 동기 및 목표

• 장기적인 유전자원 보존을 향상시키기 위해 사탕무 배아성 콜러스에 대한 단순화된 냉동보존 절차를 개발하기 위해.
• 냉동보호 전처리 최적화를 위해 DMSO와 과당 농도를 조절하여 냉동 후 생존율을 향상시키기 위해.
• 액체 질소에 장기간 저장한 후 냉동보존된 콜러스의 생존율과 재생 능력을 평가하기 위해.
• 사탕무 육성 프로그램에 적합한 비용 효율적이고 접근 가능한 냉각 방법을 수립하기 위해.

제안 방법

• CP 5243, C 91-301, C 1051-73의 세 가지 사탕무 교잡종에서 유래한 배아성 콜러스를 10% DMSO와 0.3–0.75M 과당을 포함한 냉동보호 용액으로 전처리하였다.
• 전처리된 콜러스 샘플을 −40°C 냉장고 내 알코올 용액에 담그어 0.4–0.6°C/min의 제어 냉각 속도로 냉각하였다.
• −40°C에서 2시간 동안 평형을 맞춘 후, 즉시 액체 질소에 빠르게 이송하여 장기 저장하였다.
• 해동 후 콜러스 생존율을 평가하였고, 재생된 콜러스를 배양하여 식물편생 재생 잠재력 평가를 수행하였다.
• 액체 질소에 14개월 동안 저장한 후 생존율을 테스트하여 장기 안정성 평가를 수행하였다.
• 재생된 식물편생은 형태적 평가 및 in vitro 조건에서의 생장으로 확인되었다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 사탕무 배아성 콜러스의 냉동보존 후 생존율을 최대화하는 데 가장 효과적인 냉동보호제와 농도 조합은 무엇인가?
• RQ2 제어 냉각 속도를 갖춘 단순화된 냉각 절차가 사탕무 콜러스의 냉동 후 생존율을 높일 수 있는가?
• RQ3 액체 질소에 장기간 저장하면 냉동보존된 사탕무 배아성 콜러스의 생존율과 재생 잠재력에 영향을 미치는가?
• RQ4 다양한 사탕무 품종에서 냉동보존된 배아성 콜러스로부터 완전히 발달된 식물편생을 재생시킬 수 있는가?

주요 결과

• 시험한 콜러스 라인 중에서 가장 높은 생존율은 냉동보존 후 한 사탕무 교잡종(C 1051-73)에서 94%를 기록하였다.
• 세 가지 사탕무 교잡종에서 생존율은 20%에서 94%까지 변동하여 강한 유전자형 의존적 반응을 보였다.
• 한 품종의 배아성 콜러스는 액체 질소에 14개월 동안 저장한 후에도 완전한 생존율과 재생 능력을 유지하였다.
• 재생된 콜러스는 완전히 발달된 식물편생을 성공적으로 생성하여 냉동보존 조직의 기능적 회복을 확인하였다.
• 10% DMSO와 0.3–0.75M 과당을 전처리 용액으로 사용함으로써 냉동보호 효율이 크게 향상되었다.
• −40°C 냉장고와 알코올 용액을 이용한 단순화된 냉각 방법이 0.4–0.6°C/min의 일관된 냉각 속도를 제공하여 재현 가능한 결과를 도출하였다.