[論文レビュー] Comparison of Heparin Red, Azure A and Toluidine Blue assays for direct quantification of heparins in human plasma

Ulrich Warttinger, Christina Giese+1 more|arXiv (Cornell University)|Dec 9, 2017

Proteoglycans and glycosaminoglycans research参考文献 13被引用数 6

ひとこと要約

本研究では、ヒト血漿中の未分離ヘパリンおよびエノキサパリンの直接定量を目的として、ヘパリンレッド、アズールA、トロイジンブルーの3種類のキサンチック染料ベースの試薬を評価した。ヘパリンレッドは他の試薬を上回り、臨床的に関連する範囲である1 IU/mL未塔の定量を可能にする9倍以上の感受性を示した。一方、アズールAおよびトロイジンブルーはこの範囲で失敗した。

ABSTRACT

Heparins are are sulfated polysaccharides that have tremendous clinical importance as anticoagulant drugs. Monitoring of heparin blood levels can improve patient safety. In clinical practice, heparins are monitored indirectly by their inhibtory effect on coagulation proteases. Drawbacks of these established methods have stimulated the development of simple direct detection methods with cationic dyes that change absorbance or fluorescence upon binding of polyanionic heparin. Very few such dyes or assay kits, however, are commercially and widely available to a broad community of researchers and clinicians. This study compares the performance of three commercial dyes for the direct quantification of unfractionated heparin and the widely used low-molecular-weight heparin enoxaparin. Two traditional metachromatic dyes, Azure A and Toluidine Blue, and the more recently developed fluorescent dye Heparin Red were applied in a mix-and-read microplate assay to the same heparin-spiked human plasma samples. In the clinically most relevant concentration range below 1 IU (international units) per mL, only Heparin Red is a useful tool for the determination of both heparins. Heparin Red is at least 9 times more sensitive than the metachromatic dyes which can not reliably quantify the heparins in this concentration range. Unfractionated heparin levels between 2 and 10 IU per mL can be determined by all dyes, Heparin Red being the most sensitive.

研究の動機と目的

• ヒト血漿中のヘパイン直接定量を目的とした、3種類の市販キサンチック染料試薬（ヘパリンレッド、アズールA、トロイジンブルー）の性能を評価すること。
• 未分離ヘパインおよび低分子量ヘパイン（エノキサパリン）を、臨床的に関連する濃度範囲（1 IU/mL未塔）で信頼性高く定量できる試薬を特定すること。
• ヘパイン含有ヒト血漿を用いたミックスアンドリードマイクロプレートフォーマットにおいて、染料の感受性、動的範囲、再現性を比較すること。
• 間接凝固法ベースの試薬に起因する制限を回避する、強固で直接的なヘパインモニタリング法を確立すること。

提案手法

• すべての染料を同一のヘパイン添加ヒト血漿試料に対して、ミックスアンドリードマイクロプレートアッセイフォーマットで評価した。
• ヘパリンレッド（蛍光染料）は、ヘパインのポリアンイオンと結合することで蛍光強度が増強されることを利用した。
• アズールAおよびトロイジンブルー（メタクロム的染料）は、ヘパインと結合することで吸光度が変化することを利用した。
• 試験したヘパイン濃度には、臨床的に関連する1 IU/mL未塔の範囲と、10 IU/mLまでの高濃度範囲が含まれた。
• 未分離ヘパインおよびエノキサパリンを用いて、各染料ごとに標準キャリブレーション曲線を生成した。
• アッセイの性能は、検出限界、動的範囲、および血漿マトリックス内での再現性に基づいて評価された。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 ヘパリンレッド、アズールA、トロイジンブルーは、1 IU/mL未塔の濃度でヒト血漿中の未分離ヘパインおよびエノキサパリンを信頼性高く定量できるか？
• RQ2 ヘパリンレッド、アズールA、トロイジンブルーは、血漿中のヘパインを検出する際、感受性においてどのように比較されるか？
• RQ3 どの染料ベースのアッセイが、臨床的に関連するヘパイン濃度範囲で最も正確かつ再現性の高い定量を提供するか？
• RQ4 メタクロム的染料（アズールAおよびトロイジンブルー）は、低濃度でのヒト血漿中ヘパインモニタリングに十分な感受性を示すか？
• RQ5 ヘパリンレッドは、臨床的ヘパインモニタリングにおいて間接凝固法の代替として実用的か？

主な発見

• ヘパリンレッドは、臨床的に関連する1 IU/mL未塔の範囲で、アズールAおよびトロイジンブルーと比較して少なくとも9倍高い感受性を示した。
• 1 IU/mL未塔の濃度で、ヒト血漿中の未分離ヘパインおよびエノキサパリンの両方を信頼性高く定量できるのは、ヘパリンレッドのみであった。
• アズールAおよびトロイジンブルーは、1 IU/mL未塔の範囲で感受性が不十分なため、信頼性のある定量が不可能であった。
• 2～10 IU/mLのヘパイン濃度範囲では、3種の染料すべてが両ヘパインを定量可能であり、ヘパリンレッドが最も高い感受性を示した。
• アッセイフォーマットは強固で、高スループットスクリーニングに適しており、複数試料間で一貫した結果が得られた。
• ヘパリンレッドの蛍光ベース検出は、メタクロム的染料の吸光度ベース検出に比べ、優れた信号対ノイズ比を示した。