[論文レビュー] Quantification of heparin in complex matrices (including urine) using a mix-and-read fluorescence assay

Ulrich Warttinger, Roland Krämer|arXiv (Cornell University)|Nov 8, 2016

Proteoglycans and glycosaminoglycans research参考文献 18被引用数 5

ひとこと要約

本研究では、ヘパリンが複雑なマトリックス（例：尿）に存在する場合でも、高い特異性と感度でヘパリンを定量可能な、簡単でミックスアンドリード型の蛍光アッセイを提示する。この手法により、一般的な不純物やマトリックス成分による干渉を受けることなく、低ミリグラム/ミリリットルレベルのヘパリンを直接かつ正確に検出可能であり、品質管理および薬物動態研究に適している。

ABSTRACT

Heparin is an important anticoagulant drug, about one billion doses are produced annually. It is a polydisperse sulfated polysaccharide, and the inherent heterogeneity makes the analysis of heparin difficult. The global crisis resulting from adulterated heparin in 2008 has drawn renewed attention to the challenges that are associated with the quality control and characterization of this complex biological medicine from natural sources. The present study addresses the need for simple and user-friendly analytical methods for the fast and accurate quantification of heparin in complex matrices. Direct quantification of heparin in the low microgram per mL range was accomplished using a specific commercially available assay based on the fluorescent molecular probe Heparin Red, simply by mixing the heparin containing sample and a reagent solution in a 96-well microplate followed by fluorescence readout. A screening of typical impurities in raw heparin (selected other glycosaminoglycans, residual nucleic acids and proteins), related to the extraction from animal tissues, as well as of components of the urine matrix (inorganic salts, amino acids, trace proteins) revealed that these compounds even in large excess have no or very little effect on the accuracy of heparin determination. Heparin spike detection in urine, a biological multicomponent matrix, also showed good accuracy. We envision applications of this mix-and-read assay in the process and quality control in heparin manufacturing, but also in pharmacokinetic studies as a convenient tool for measuring of the urinary excretion of heparins.

研究の動機と目的

• 尿のような複雑な生物学的マトリックスにおけるヘパリンを迅速かつ使いやすい方法で定量するための開発。
• ヘパリンの多分散的・不均一な性質および歴史的な不純物混入問題に起因する分析上の課題に対処する。
• 原材料ヘパリンに含まれる一般的な不純物および尿成分に対するアッセイの特異性と頑健性を評価する。
• 製薬製造における品質管理および薬物動態研究における尿中排泄モニタリングへの実用的応用を可能にする。

提案手法

• 商業的に入手可能なHeparin Redプローブを用いたミックスアンドリード型の蛍光アッセイを採用した。このプローブはヘパリンに特異的に結合し、結合することで蛍光強度が増強される。
• 試料は96ウェルマイクロプレート形式でHeparin Red試薬と混合し、高スループット分析を可能にした。
• 混合後、直接蛍光強度を測定し、既知のヘパリン濃度から作成した標準曲線に基づいて定量した。
• グリコサミノグリカン、核酸、タンパク質、無機塩、アミノ酸、微量タンパク質などの潜在的なマトリックス成分を用いた干渉試験を実施した。
• 生物学的条件下で回収率と正確性を評価するため、尿試料にヘパリンをスパイクした。
• 線形性、検出限界、および複雑なマトリックス内での精度についてのバリデーションを実施した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 簡単でミックスアンドリード型の蛍光アッセイは、尿のような複雑なマトリックスにおいても、ヘパリンの正確な定量を達成できるか？
• RQ2 原材料ヘパリンに含まれる一般的な不純物や尿成分が、蛍光ベースのヘパリン検出にどの程度干渉するか？
• RQ3 このアッセイは、生物学的試料において低ミリグラム/ミリリットル濃度のヘパリンを検出するのに十分な感度と特異性を有しているか？
• RQ4 この手法は、ヘパリンの尿中排泄を伴う薬物動態研究および製薬品質管理に信頼性を持って応用可能か？

主な発見

• アッセイにより、高感度かつ再現性に優れた低ミリグラム/ミリリットル範囲でのヘパリンの直接的定量が可能となった。
• グリコサミノグリカン、核酸、タンパク質、無機塩、アミノ酸、または微量タンパク質のうち選択された物質について、大きな過剰量であっても顕著な干渉は観察されなかった。
• 尿マトリックスにおけるヘパリンスパイク回収率は正確であり、生物学的に複雑な環境下でも本手法の頑健性が裏付けられた。
• ミックスアンドリード形式により、サンプル前処理を要せず、高スループットで低コストかつ使いやすい分析が可能となった。
• 工業的品質管理およびヘパリン排泄の薬物動態研究への応用に強く有望な可能性を示した。