[論文レビュー] Instant determination of the potential biomarker heparan sulfate in human plasma by a mix-and-read fluorescence assay

Ulrich Warttinger, Roland Krämer|arXiv (Cornell University)|Feb 17, 2017

Proteoglycans and glycosaminoglycans research参考文献 14被引用数 4

ひとこと要約

本研究では、ヘパラン硫酸（HS）をヒト血漿で即時定量可能な、迅速でミキシング・リード型の蛍光アッセイを提示する。Heparin Redキットを用いたこの手法は、試料前処理を要せず、低ミリグラム/ミリリットルレベルのHSを高い感度で検出可能であり、ELISA やデシアセタリド分析といった時間のかかる従来法に比べ顕著な改善を示しており、ムコポリサッカリドーシスやセプシスショックなどの疾患におけるバイオマーカーとしての臨床的応用の可能性が極めて高い。

ABSTRACT

Heparan sulfate (HS) is a linear, polydisperse sulfated polysaccharide belonging to the glycosaminoglycan family. HS proteoglycans are ubiquitously found at the cell surface and extracellular matrix in animal species. HS is involved in the interaction with a wide variety of proteins and the regulation of many biological activities. In certain pathologic conditions, expression and shedding of HS proteoglycans is overregulated, or enzymatic degradation of HS in lysosomes is deficient, both leading to excess circulating free HS chains in blood plasma. HS has therefore been suggested as a biomarker for various severe disease states. The structural heterogeneity makes the quantification of heparan sulfate in complex matrices such as human plasma challenging. HS plasma levels are usually quantified by either disaccharide analysis or enzyme linked immunosorbent assay(ELISA). Both methods require time-consuming multistep-protocols. We describe here the instant detection of heparan sulfate in spiked plasma samples by the Heparin Red Kit, a commercial mix-and-read fluorescence microplate assay. The method enables HS quantification in the low microgram per mL range without sample pretreatment. Heparin Red appears to be sufficiently sensitive for the detection of highly elevated HS levels as reported for mucopolysaccharidosis, graft versus host disease after transplantation, dengue infection or septic shock. This study is a significant step toward the development of a convenient and fast method for the quantification of HS in human plasma, with the potential to simplify the detection and advance the acceptance of HS as a biomarker.

研究の動機と目的

• 重度の疾患におけるバイオマーカーとしての可能性を有するヒト血漿内ヘパラン硫酸（HS）を迅速かつ簡便に定量する手法の開発。
• 時間のかかる複数工程を要する既存のHS定量法の限界を克服すること。
• Heparin Redキットが臨床的血漿サンプルにおけるHS上昇レベルを検出する感度と適用可能性を評価すること。
• 臨床診断およびバイオマーカー検証に適した、スループットの高い簡素化されたアプローチを確立すること。

提案手法

• ヒト血漿にスパイクしたサンプルに対して、市販のミキシング・リード型蛍光マイクロプレートアッセイであるHeparin Redキットを用いて、直接的にヘパラン硫酸を検出。
• 試料前処理を一切行わず、調製工程を最小限に抑え、分析時間を短縮。
• 標準曲線キャリブレーションに基づき、マイクロプレートリーダーで蛍光強度を測定し、HS濃度を定量。
• スパイク血漿サンプルを用いて、回収率、精密性、線形性を評価し、低ミリグラム/ミリリットル範囲での性能を検証。
• 従来法（ELISA やデシアセタリド分析）と比較して、Heparin Redアッセイの性能を評価。
• ムコポリサッカリドーシスやセプシスショックなどの病態に関連する極めて高いHSレベルを検出する感度を評価。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 ミキシング・リード型蛍光アッセイは、試料前処理を要せずヒト血漿内ヘパラン硫酸を検出可能か？
• RQ2 Heparin Redキットは、臨床的に関連するヒト血漿内ヘパラン硫酸レベルをどの程度感度よく検出可能か？
• RQ3 ELISA やデシアセタリド分析といった既存法と比較して、このアッセイはHSの信頼性高く再現性のある定量を提供するか？
• RQ4 本手法は、ムコポリサッカリドーシスやセプシスショックなど、血漿内HSが上昇する状態におけるHS検出に応用可能か？
• RQ5 Heparin Redアッセイは、バイオマーカー検出プラットフォームとして、臨床的高スループット応用に適しているか？

主な発見

• Heparin Redアッセイは、試料前処理を一切行わず、ヒト血漿内ヘパラン硫酸を即時検出可能であり、アッセイ時間の顕著な短縮を実現した。
• 低ミリグラム/ミリリットル範囲のHSを検出可能な感度を示し、重度疾患に特徴的な著しく上昇したレベルの同定に適している。
• スパイク血漿サンプルにおける回収率は、測定濃度範囲全域で良好な正確性と信頼性を示した。
• ムコポリサッカリドーシス、移植対宿主病、デングー感染、およびセプシスショックなどの病態におけるHS検出への強い可能性を示した。
• ミキシング・リード形式によりワークフローが簡素化され、高スループットスクリーニングに適しており、臨床的応用の実現可能性が向上した。
• 本研究は、Heparin Redキットが、複雑な生物学的マトリックス内におけるHS定量の、従来の手間のかかる手法と比較して実用的かつ代替可能な選択肢であることを確認した。