[論文レビュー] Micropropagation of three genotypes of Indian mustard [{Brassica juncea} (L.) Czern.] using seedling-derived transverse thin cell layer (tTCL) explants

Michel Aoun, Gilbert Charles+1 more|ArXiv.org|Jul 7, 2008

Plant tissue culture and regeneration参考文献 23被引用数 4

ひとこと要約

本研究では、7日齢の無菌状態のブロスィカ・ジュンセア（インドンンマス）種子lingsから採取した横断的薄層細胞（tTCL）の外植体を用いて、3つのインドンンマス（Brassica juncea）系統に対して効率的な微増殖プロトコルを確立した。MS培地に26.6 µM BAPおよび3.22 µM NAAを添加した培地に10 µMの硝酸銀を加えることで、系統2の子葉由来tTCL外植体で1つの外植体あたり4.45本の芽を誘発し、最多で100％の芽再生が達成された。また、グリーンハウスでの環境適応後の植物体では99％の生存率と正常な花咲きと種子形成が確認された。

ABSTRACT

Micropropagation of three genotypes of Indian mustard [ extit{Brassica juncea} (L.) Czern.] using 7-days old seedling-derived transverse thin cell layer (tTCL) explants was accomplished. The genotype, explant source and addition of silver nitrate to the medium significantly influenced shoot bud induction. MS medium with 26.6 $μ$M of 6-Benzylaminopurin (BAP) and 3.22 $μ$M of 1-naphtaleneacetic acid (NAA) was identical (in the case of cotyledon tTCLs whatever the organ) and superior for the induction of buds (in the cases of petiole tTCL explants of genotypes 1 and 2 and hypocotyl tTCL explants of genotypes 1 and 3) than 53.3 $μ$M of BAP and 3.22 $μ$M of NAA. However, 53.3 $μ$M of BAP was superior for the induction of buds than 26.6 $μ$M in the presence of the same concentration of NAA for petiole tTCL explants of genotype 3 and hypocotyl tTCL explants of genotype 2. The addition of silver nitrate significantly enhanced the rate of shoot induction in all genotypes. Cotyledon-derived tTCL explants exhibited the highest shoot bud induction potential and was followed by petiole- and hypocotyl-derived ones. Addition of 10 $μ$M of silver nitrate to BAP and NAA supplemented medium induced higher frequency shoot bud induction (up to 100 %) with the highest means of 4.45 shoots per cotyledon-derived tTCL explants obtained with the genotype 2. Shoot regenerated were rooted on MS basal medium without PGRs which induced 99 % of roots per shoot. The plantlets established in greenhouse conditions with 99 % survival, flowered normally and set seeds.

研究の動機と目的

• インドンンマス（Brassica juncea）の高頻度微増殖システムを、tTCL外植体を用いて開発すること。
• 系統、外植体タイプ（子葉、petiole、下胚軸）および硝酸銀の影響が芽再生に与える影響を評価すること。
• tTCL培養において最大の芽誘発をもたらすBAPおよびNAAの濃度を最適化すること。
• 再生した植物体のin vitro再生およびex vitro環境適応のための信頼性のあるプロトコルを確立すること。
• tTCL外植体が今後の遺伝子組み換えおよび植物修復応用においてBrassica属に応用可能である可能性を評価すること。

提案手法

• 7日齢の無菌状態のブロスィカ・ジュンセア種子lingsの子葉、petiole、下胚軸から400–500 µmの厚さのtTCL外植体を切り出し、
• MS基礎培地に0.6％アガー、2％スクロース、および変動するBAP（26.6–53.3 µM）およびNAA（3.22 µM）を添加した培地にtTCLを培養した。
• 硝酸銀の濃度（0–20 µM）を変化させ、芽再生頻度および1外植体あたりの芽数に与える影響を評価した。
• 12時間の光周期（60 µmol·m⁻²·s⁻¹）で22/20°Cの条件下に培養し、滅菌前にはpHを5.8に調整した。
• 再生した芽をホルモン不使用のMS培地に移し、その後グリーンハウス条件でのハードニングを行った。
• 処理および系統間の統計的差を分析するために一元配置分散分析（one-way ANOVA）およびLSD検定（p < 0.05または0.01）を用いた。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 7日齢の種子lingsから採取したtTCL外植体を用いることで、ブロスィカ・ジュンセアにおいて高頻度の芽再生が達成可能か？
• RQ2 B. junceaの異なる系統は、tTCL培養においてBAPおよびNAAの濃度にどのように反応するか？
• RQ3 硝酸銀は、系統および器官タイプにかかわらず、tTCL外植体の芽再生頻度および1外植体あたりの芽数にどのような影響を及ぼすか？
• RQ4 どの外植体源（子葉、petiole、下胚軸）がB. junceaのtTCL培養において最も高い再生可能性を示すか？
• RQ5 再生した植物体は、グリーンハウス条件で正常に環境適応し、正常な花咲きと種子形成に到達できるか？

主な発見

• MS培地に26.6 µM BAPおよび3.22 µM NAAを添加した培地に10 µMの硝酸銀を加えることで、系統2（AB79/1）の子葉由来tTCL外植体で100％の芽再生頻度が達成された。
• 最適条件下で系統2（AB79/1）は1つのtTCLあたり平均4.45本の芽を生成し、他の系統と比べ顕著に優れていた。
• 子葉由来tTCL外植体が、全系統において最も高い再生可能性を示し、次いでpetioleおよび下胚軸由来外植体の順であった。
• 系統3（J99）では、petioleおよび下胚軸由来tTCLの芽誘発において、53.3 µM BAPが26.6 µM BAPよりも効果的であった。これは系統特異的な反応を示している。
• ホルモン不使用のMS培地で根の形成効率は99％に達し、グリーンハウスでの環境適応後も99％の植物体が生存し、正常な花咲きと種子形成が確認された。
• サブカリングおよび環境適応後、再生した植物体に形態的異常は認められず、再生系統の遺伝的安定性が確認された。