[論文レビュー] Quantification of Pollen Viability in Lantana camara By Digital Holographic Microscopy

Vipin Kumar, Nishant Goyal+4 more|arXiv (Cornell University)|Oct 10, 2022

Digital Holography and Microscopy被引用数 14

ひとこと要約

本研究では、デジタルホログラム顕微鏡（DHM）を用いた stain-free な新規手法を提案し、*Lantana camara* の花粉の発芽能を定量的に評価する。この手法は、染色を要せず、定量的位相差像を取得することで、クロマチン含量および細胞の健全性を評価できる。高解像度で非侵襲的な分類が可能であり、植物の生殖生物学および侵入生物学分野へのスケーラブルで統計的に信頼性の高い手法を提供する。

ABSTRACT

Pollen grains represent the male gametes of seed plants and their viability is critical for efficient sexual reproduction in the plant life cycle. Pollen analysis is used in diverse research thematics to address a range of botanical, ecological and geological questions. More recently it has been recognized that pollen may also be a vector for transgene escape from genetically modified crops, and the importance of pollen viability in invasion biology has also been emphasized. In this work, we analyse and report an efficient visual method for assessing the viability of pollen using digital holographic microscopy (DHM). We test this method on pollen grains of the invasive Lantana camara, a well known plant invader known to most of the tropical world. We image pollen grains and show that the quantitative phase information provided by the DHM technique can be readily related to the chromatin content of the individual cells and thereby to pollen viability. Our results offer a new technique for pollen viability assessment that does not require staining, and can be applied to a number of emerging areas in plant science.

研究の動機と目的

• 侵入植物種における染色を要しない、花粉発芽能の定量的評価手法を開発すること。
• デジタルホログラム顕微鏡（DHM）を用いて、水分状態の花粉粒をラベルフリーで高解像度でイメージングする可能性を検討すること。
• 定量的位相差とクロマチン含量および細胞の健全性を関連付けることで、発芽能を推定すること。
• 従来の染色手順を用いずに、DHMによる発芽能あり・なしの分類可能性を評価すること。
• 今後の応用として、この手法を侵入生物学およびC値の定量的評価による倍数体レベルの推定に応用することを検討すること。

提案手法

• 1ショット、フル解像度のデジタルホログラム顕微鏡（DHM）システムを用い、明視野および定量的位相差イメージングの2モードで運用した。
• スパース最適化に基づく位相回復アルゴリズムを用いて、ホログラムから高精度な定量的位相差マップを再構成した。
• 生理的関連性を確保するため、500個以上の個々の *Lantana camara* の花粉粒を水分状態でイメージングした。
• 同じ花粉粒に対して、再位置決めや撹乱を伴わず、明視野および定量的位相差画像を取得した。
• 各花粉粒から30個の定量的位相差パラメータを抽出し、主に平均位相値を発芽能の主な指標とした。
• 細胞質の有無を発芽能の代理指標として用い、位相差マップの形状と既知の発芽能マーカーを関連付けた。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 DHMによる定量的位相差像は、染色を要せず、*Lantana camara* の発芽能あり・なしの花粉を信頼性高く区別できるか？
• RQ2 花粉の定量的位相差マップは、クロマチン含量および細胞の健全性とどのように相関するか？
• RQ3 植物の生殖研究において、従来の染色ベースの発芽能測定法に、DHMがどの程度置き換え可能か？
• RQ4 染色されていない花粉粒の位相差を用いて、統計的に信頼性のある発芽能分類が可能か？
• RQ5 DHMは、花粉におけるC値の定量的評価を通じて、倍数体レベルを推定する可能性を有するか？

主な発見

• DHMシステムは、サンプルの操作を伴わず、明視野および定量的位相差モードの両方で、*Lantana camara* の花粉に対して回折限界に達する解像度の画像を正常に取得した。
• 定量的位相差マップは、細胞質の有無に基づき、発芽能あり・なしの花粉を明確に区別でき、発芽能ありの花粉は高い位相差を示した。
• 500個以上の花粉粒から抽出した平均位相値は、染色を要しない統計的に信頼性の高い発芽能指標を提供した。
• 本手法は、染色されておらず水分状態の花粉においても、自然な屈折率対比により、信頼性の高い発芽能分類が可能であることを示した。
• 予備的なデータから、高度な位相差パラメータ解析を用いることで、DHMをC値の定量的評価および倍数体レベルの推定に応用可能である可能性が示唆された。
• 本手法は、最小限のサンプル処理で高スループットかつ非侵襲的なイメージングが可能であり、染色法に代わるスケーラブルな代替手法を提供する。