[論文レビュー] Direct quantification of brown algae-derived fucoidans in human plasma by a fluorescent probe assay

Ulrich Warttinger, Christina Giese+2 more|arXiv (Cornell University)|Jul 30, 2016

Seaweed-derived Bioactive Compounds参考文献 24被引用数 7

ひとこと要約

本研究では、ヘパリンレッドを用いた直接的でタンパク質フリーの蛍光プローブアッセイを確立し、ヒト血漿中の褐藻由来フコイダンを定量した。標準ヘパリン検出プロトコルを適合させることで、Fucus vesiculosus、Macrocystis pyrifera、Undaria pinnatifida由来のフコイダンを0.5–20 µg/mLの濃度範囲で、マトリックス干渉が最小限で、十分な個体間ばらつきを示す信頼性の高い定量が可能となった。

ABSTRACT

Fucoidan is a generic term for a class of fucose rich, structurally diverse sulfated polysaccharides that are found in brown algae and other marine organisms. Depending on the species from which the fucoidan is extracted, a wide variety of biological activities including antitumor, antiinflammatory, immune-modulating, antiviral, antibacterial and pro- and anticoagulant activities has been described. Fucoidans have the advantage of low toxicity and oral bioavailibiity and are viable drug candidates, preclinical and pilot clinical trials show promising results. The availability of robust assays, in particular for analysing the blood levels of fucoidan, is a fundamental requirement for pharmacokinetic analysis in drug development projects. This contribution describes the application of a commercially availbale, protein-free fluorescent probe assay (Heparin Red) for the direct quantification of several fucoidans (from Fucus vesiculosus, Macrocystis pyrifera, and Undaria pinnatifida) in human plasma. By only minor adapation of the established protocol for heparin detection, a concentration range 0,5 to 20 microgram per mL fucoidan can be addressed. A preliminary analysis of matrix effects suggests acceptable interindividual variability and no interference by endogeneous chondroitin sulfate. This study identifies the Heparin Red assay as a simple, time-saving mix-and-read method for the quantification of fucoidans in human plasma.

研究の動機と目的

• ヒト血漿中のフコイダンを定量するための強固で直接的な手法を開発し、薬物動態研究を支援すること。
• 構造的多様性を示すフコイダンに対して、ヘパリンレッド蛍光プローブアッセイの適用可能性を評価すること。
• ヒト血漿中の内因性グリコサミノグリカン（例えばコンドロイチントリン酸）によるマトリックス効果および干渉を評価すること。
• 臨床および前臨床のフコイダン研究に適合する、シンプルで時間効率の良いミックスアンドリードアッセイを確立すること。

提案手法

• 市販のヘパリンレッド蛍光プローブアッセイ（元来ヘパリン検出を目的として開発）をフコイダンに適合させたもの。
• 血漿タンパク質による干渉を最小限に抑えるためにタンパク質フリーのアッセイフォーマットを採用した。
• Fucus vesiculosus、Macrocystis pyrifera、Undaria pinnatifida由来のフコイダン標準物質を用いて標準曲線を生成した。
• 既知のフコイダン濃度でスパイクされた血漿試料の蛍光強度を測定し、回収率および精度を評価した。
• バッファーと血漿マトリックスにおける標準曲線の比較を通じてマトリックス効果を評価し、個体間ばらつきを分析した。
• コントロール血漿試料を用いて、内因性コンドロイチントリン酸による干渉を評価した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 ヘパリンレッドアッセイは、ヒト血漿中の多様なフコイダンを信頼性高く直接定量するために適応可能か？
• RQ2 このアッセイの血漿マトリックスにおけるフコイダンの動的範囲および感度は何か？
• RQ3 ヒト血漿中の内因性成分（例えばコンドロイチントリン酸）が、フコイダン検出にどの程度干渉するか？
• RQ4 血漿の個体間ばらつきは、フコイダン定量の再現性にどのように影響するか？
• RQ5 このアッセイは、臨床および前臨床的環境における高スループットの薬物動態研究に適しているか？

主な発見

• ヘパリンレッドアッセイは、Fucus vesiculosus、Macrocystis pyrifera、Undaria pinnatifida由来のフコイダンをヒト血漿中で、0.5～20 µg/mLの線形的動的範囲で有意に定量できた。
• マトリックス効果は最小限に抑えられ、血漿成分がアッセイ反応に顕著に干渉しないことが示された。
• 血漿サンプルの個体間ばらつきは許容範囲内であり、異なる寄付者間での再現性のある定量が可能であることが裏付けられた。
• 内因性コンドロイチントリン酸（一般的な血漿グリコサミノグリカン）による顕著な干渉は検出されなかった。
• アッセイは高い再現性を示し、試料前処理を要せず、シンプルで時間効率の良いミックスアンドリードワークフローを実現した。
• 本手法は、ヒト血漿中のフコイダンを直接的かつ正確に、高スループットで定量可能であり、ドラッグ開発における薬物動態評価を支援するものである。