[논문 리뷰] Bright and fast voltage reporters across the visible spectrum via electrochromic FRET (eFRET)

Peng Zou, Yongxin Zhao외 7명|arXiv (Cornell University)|2014. 03. 18.

Photoreceptor and optogenetics research참고 문헌 33인용 수 5

한 줄 요약

이 논문은 전기색소 FRET(electrochromic FRET, eFRET) 기반의 유전자로 발현되는 전압 영상 시스템을 제시한다. 여기서 전압에 민감한 로도프신 도메인은 부착된 형광 단백질의 형광 죽음을 조절한다. 이 시스템은 가시광선 전역에서 밝고 빠른 전압 보고자를 제공하며, 100 mV당 6–10% ΔF/F의 감도와 밀리초 이하의 반응 시간을 보이며, 뉴런에서 고신호대잡음비(SNR)의 다색 전압 영상 촬영이 가능하다.

ABSTRACT

We present a palette of brightly fluorescent genetically encoded voltage indicators (GEVIs) with excitation and emission peaks spanning the visible spectrum, sensitivities from 6 - 10% Delta F/F per 100 mV, and half-maximal response times from 1 - 7 ms. A fluorescent protein is fused to an Archaerhodopsin-derived voltage sensor. Voltage-induced shifts in the absorption spectrum of the rhodopsin lead to voltage-dependent nonradiative quenching of the appended fluorescent protein. Through a library screen, we identified linkers and fluorescent protein combinations which reported neuronal action potentials in cultured rat hippocampal neurons with a single-trial signal-to-noise ratio from 6.6 to 11.6 in a 1 kHz imaging bandwidth at modest illumination intensity. The freedom to choose a voltage indicator from an array of colors facilitates multicolor voltage imaging, as well as combination with other optical reporters and optogenetic actuators.

연구 동기 및 목표

• 다양한 가시광선 스펙트럼을 커버하는 다색 유전자로 발현되는 전압 지표(GEVIs) 팔레트를 개발하기 위해.
• 높은 감도(100 mV당 6–10% ΔF/F)와 빠른 반응 시간(<7 ms)을 확보하여 작동 전압의 신뢰성 있는 감지를 위해.
• 색채 다양성을 통해 옵토지노믹스 도구 및 기타 광학 보고자와의 호환성을 확보하기 위해.
• 실생활 뉴런에서 견고한 전압 보고를 위한 최적의 형광 단백질 및 리간드 조합을 규명하기 위해.

제안 방법

• 아르케아로도프신에서 유래한 전압에 민감한 로도프신을 형광 단백질에 융합하여 eFRET 시스템을 구축하였다.
• 로도프신의 전압 유도 스펙트럼 이동을 이용해 형광체로의 비방사 에너지 전달을 조절하였다.
• 빛기, 감도, 반응 동역학을 최적화하기 위해 형광 단백질-리간드 융합체의 라이브러리를 선별하였다.
• in vitro 및 배양된 랩의 해마 뉴런에서 전압 의존적 형광 죽음을 측정하였다.
• 생리적 조명 조건 하에서 신호대잡음비(SNR)를 평가하기 위해 1 kHz 영상 대역폭을 사용하였다.
• in vivo 적용을 위해 SNR, 반응 시간, 스펙트럼 특성을 바탕으로 최적의 구조를 선별하였다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 단일 eFRET 플랫폼이 가시광선 전역에서 조절 가능한 흡수 및 발광을 갖춘 전압 보고자를 생성할 수 있는가?
• RQ2 높은 감도와 빠른 반응을 위한 최적의 형광 단백질 및 리간드 조합은 무엇인가?
• RQ3 이 보고자들은 살아있는 뉴런에서 단일 행동전위를 고신호대잡음비로 해상할 수 있는가?
• RQ4 이 eFRET 팔레트를 통해 얼마나 높은 수준의 다색 전압 영상 촬영이 가능할 수 있는가?
• RQ5 조명 강도가 이 보고자들을 사용한 행동전압의 탐지 가능성에 어떤 영향을 미치는가?

주요 결과

• eFRET 시스템은 가시광선 전역에서 흡수 및 발광 최대값을 갖는 전압 보고자를 생성하였다.
• 감도는 100 mV당 6%에서 10% ΔF/F로 다양했으며, 세포막 전위 변화의 강력한 감지를 가능하게 하였다.
• 반응 시간은 최대 1 ms였고, 모든 구조물이 최대 반응의 50%에 도달하는 데 7 ms 이내였다.
• 배양된 랩의 해마 뉴런에서 1 kHz 영상 대역폭 조건에서 단일 시험의 SNR는 6.6에서 11.6 사이였다.
• 스펙트럼적으로 구분 가능한 보고자가 가용하므로, 이 시스템은 다색 전압 영상 촬영을 가능하게 하였다.
• 최적의 구조물은 낮은 조명 조건에서도 높은 성능을 유지하여, 실세포 영상에 적합하였다.