[論文レビュー] Reducing Photobleaching in STED Microscopy with Higher Scanning Speed

Yong Wu|arXiv (Cornell University)|Aug 7, 2014

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques被引用数 1

ひとこと要約

本研究では、共振スキャンSTED顕微鏡における走査速度を向上させることで、光分解が著しく軽減され、特に高強度の除去レーザー条件下で発光効率が向上することを示している。8倍広い視野を有する条件下では、0.2 GW·cm⁻²を超える時間平均の除去照射強度下で、Atto 647N染料の発光生存時間が約80%延長された。これは、光分解が主に励起状態のフルオロフォアに対して作用する除去レーザーによって引き起こされていることを確認している。

ABSTRACT

Photobleaching is a major limitation of superresolution Stimulated Depletion Emission (STED) microscopy. Fast scanning has long been considered an effective means to reduce photobleaching in fluorescence microscopy, but a careful quantitative study of this issue is missing. In this paper, we show that the photobleaching rate in STED microscopy is slowed down and fluorescence yield is enhanced by scanning with high linear speed, enabled by the large field of view in our custom-built resonant-scanning STED microscope. The effect of scanning speed on photobleaching and fluorescence yield is more remarkable at higher levels of depletion laser irradiance, and virtually disappears in conventional confocal microscopy. With a depletion irradiance of >0.2 GW$\cdot$cm$^{-2}$ (time average), we were able to extend the fluorescence survival time of the Atto 647N dye by ~80% with an 8-fold wider field of view. We confirm that STED Photobleaching is primarily caused by the depletion light acting upon the excited fluorophores. Experimental data agree with a theoretical model. Our results encourage further increasing linear scanning speed for photobleaching reduction in STED microscopy.

研究の動機と目的

• スーパーレゾリューションイメージングの主な制限要因である光分解に及ぼす走査速度の影響を調査すること。
• 走査速度を速くすることで、フルオロフォアが除去レーザーにさらされる時間の長さを短くし、光分解が軽減されるかどうかを特定すること。
• 走査速度、視野、およびさまざまな除去レーザー強度下での発光生存との関係を定量すること。
• パルス状の除去励起下での光分解ダイナミクスを記述する理論モデルを構築し、実験的結果を検証すること。
• STEDにおける光分解が主に励起状態のフルオロフォアに対して作用する除去レーザーによって引き起こされることを確立すること。

提案手法

• 広視野を有する高線形走査速度を実現可能な、カスタム製の共振スキャンSTED顕微鏡を用いた。
• 視野を変更することで走査速度を変化させ、同時にレーザー出力およびイメージング条件を一定に保った。
• 異なる走査速度および除去レーザー照射強度下での発光強度の時間的減衰を測定した。
• Atto 647N標識標本を用いた時間分解画像法により、光分解速度および発光生存時間を定量した。
• パルス状の除去励起下での光分解ダイナミクスを記述する理論モデルを構築し、適用した。
• 共焦点検出あり・なしの両条件で、さまざまな走査速度および除去強度下での結果を比較した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 走査速度を向上させることでSTED顕微鏡における光分解が軽減されるか。その効果はどの程度か？
• RQ2 走査速度の光分解への影響は、除去レーザー照射強度が上昇するにつれてどのように変化するか？
• RQ3 STED顕微鏡における光分解は、主に励起状態のフルオロフォアに対して作用する除去レーザーによって引き起こされるか？
• RQ4 高走査速度下で視野の広さが光分解速度に及ぼす影響はどの程度か？
• RQ5 実験的結果は、パルス状の除去励起下での光分解ダイナミクスの理論モデルとどの程度整合するか？

主な発見

• 走査速度を向上させることで、特に高強度の除去レーザー条件下でSTED顕微鏡における光分解が顕著に軽減された。
• 8倍広い視野を有する条件下では、時間平均の除去照射強度が0.2 GW·cm⁻²を超える領域で、Atto 647N染料の発光生存時間が約80%延長された。
• 光分解軽減効果は、高強度の除去レーザー下で顕著であり、従来の共焦点顕微鏡では顕著でなかった。
• 実験データは、光分解が主に励起状態のフルオロフォアに対して作用する除去レーザーによって引き起こされるという理論モデルを強く支持した。
• 発光効率の向上および光分解の低減は、すべて走査速度の向上に起因し、除去ビームへの露出時間を短くしたことに起因していた。
• 本結果は、線形走査速度をさらに向上させることは、STED顕微鏡における光分解低減の有効で実用的な戦略であると示唆している。